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rhPTH1-34对成骨细胞增殖及BMP-7、BMP-9基因表达的影响
目的 研究重组人甲状旁腺激素1-34(rhPTH1-34)对成骨细胞增殖及BMP-7、BMP-9基因表达的影响.方法 通过不同剂量的重组人甲状旁腺素(rhPTH1-34)(0、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)间歇性(24 h/周期,前12 h rhPTH1-34干预)刺激体外培养的成骨细胞,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力,RT-PCR法检测成骨细胞BMP-7、BMP-9基因的表达.结果 间歇性小剂量rhPTH1-34可明显促进成骨细胞的增殖能力及增强BMP-7、BMP-9基因的表达.结论 间歇性小剂量rhPTH1-34可促进成骨细胞增殖,可能与BMP-7、BMP-9基因表达相关.
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BMP-9与骨代谢及糖代谢关系研究进展
骨形成蛋白-9(BMP-9)是从胚胎鼠的肝脏cDNA文库中克隆得到的新型细胞因子,属于转化生长因子β超家族的成员,由肝脏非实质细胞合成分泌,在体内以类激素的形式发挥广泛的生物学作用.BMP-9不仅具有强烈的骨诱导活性,促进成骨细胞分化,还可通过调控糖代谢过程中关键酶的表达、促进胰岛素合成及分泌、增加胰岛素敏感性等方式调节体内葡萄糖平衡.本文主要对BMP-9与骨代谢及糖代谢的关系进行综述,为深入认识糖尿病、代谢性骨病及糖尿病性骨质疏松的发生机理提供理论依据,为糖尿病和骨骼疾病的防治提供新的思路.
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BMP-9/EPO双基因共转染ADSCs复合nHAC/PLA支架修复兔下颌骨缺损的实验研究
目的:探讨腺病毒介导BMP-9/EPO双基因共转染脂肪干细胞(ADSCs)复合nHAC/PLA支架材料促进体内成骨的可行性.方法:分离培养兔ADSCs,利用重组腺病毒构建携带BMP-9、EPO、BMP-9/EPO基因的表达载体,并转染至兔ADSCs.14 d后,在荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况,计算病毒转染效率,采用Western免疫印迹检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白的表达.50只大白兔随机分为5组,A组为空白组,B组为单纯材料组,C组为BMP-9/nHAC/PLA组.D组为EPO/nHAC/PLA组,E组为BMP-9/EPO/nHAC/PLA组.制备兔双侧下颌骨缺损模型,按照实验分组,将转染组细胞分别与nHAC/PLA支架复合培养后植入兔下颌骨缺损处,于4、8、12周在缺损处取材进行影像学、组织学检测及扫描电镜观察,比较各组动物下颌骨缺损修复情况.采用SPSS17.0软件包对结果进行统计学分析.结果:荧光显微镜下观察,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs,转染效率为80％-93％.转染后,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO基因和蛋白均能稳定表达.转染后的ADSCs与nHAC/PLA支架复合,其骨缺损区修复情况优于对照组,且BMP-9/EPO/nHA C/PLA组成骨情况优于其他各组.扫描电镜下见转染组骨缺损与材料结合修复情况优于对照组,BMP-9/EPO/nHAC/PLA组修复明显.结论:BMP-9、EPO均可转染ADSCs并稳定表达.与nHAC/PLA支架材料复合后,可显著促进下颌骨缺损的修复,为骨组织修复工程提供了新的选择.
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肱骨骨折后异位骨化形成中BMP-2、BMP-9及TNF-α表达的变化
目的:探究在肱骨骨折后,骨形态形成蛋白(BMP)-2、BMP-9及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达量对异位骨化过程中的影响.方法:A组为肱骨折且合并严重软组织损伤,后期发生异位骨化病人的骨化标本,共17例;B组为肱骨骨折未合并严重软组织损伤,后期发生异位骨化病人的骨化标本,共15例;C组为肱骨骨折未合并异位骨化病人骨折附近的组织标本,共18例.用免疫组化法测定A、B和C组标本中BMP 2、BMP-9及TNF-α的表达量.结果:BMP-2、BMP-9及TNF-α在A、B和C组均有表达,其中BMP-2,BMP-9及TNF-α在A、B和C组中的表达具有差异性(P＜0.05),且BMP-9在A组和B组中表达具有差异性(P＜0.05).结论:BMP-2和BMP-9表达水平上调是肱骨骨折后异位骨化发生的重要机制,其中BMP-9只在骨折合并软组织损伤中发挥作用,而BMP-2在骨化过程中均发挥着重要作用,与软组织是否受损无关.TNF-α可以减缓骨化的发生,一定程度上抵消BMP-2和BMP-9所发挥的作用.
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Hey1表达对BMP-9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化及增殖影响
目的 探讨Notch信号通路重要靶点Hey1表达水平改变对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化与增殖的影响.方法 构建过表达Hey1慢病毒LV-Hey1、抑制Hey1表达慢病毒LV-shHey1,分别感染C3H10T1/2细胞干预Hey1表达水平,以LV-Blank(空质粒)感染C3H10T1/2细胞作为对照;以荧光显微镜对慢病毒感染效果、实时荧光定量PCR以及Western blot对Hey1表达水平进行验证,筛选不同Hey1表达水平的稳定细胞系.用含BMP-9的条件培养基诱导不同Hey1表达水平的C3H10T1/2细胞(分别为BMP-9+C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组),以正常培养基培养的细胞作为对照(C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组).培养后48 h,实时荧光定量PCR及Western blot测定成骨分化相关转录因子Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达水平;4、5、6、7d行MTT检测及4、5、10d行流式细胞仪测定细胞增殖能力;4、7d时ELISA测定细胞ALP表达水平并行染色观察.结果 成功建立不同Hey1表达水平稳定细胞系.成骨方面,各时间点与BMP-9+C3H10T1/2组比较,BMP-9诱导下Hey1过表达的BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组细胞Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达水平以及成骨分化标志物ALP含量均显著增加(P＜0.05),抑制Hey1表达的BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组细胞以上指标均显著降低(P＜0.05).对细胞增殖活力影响方面,与BMP-9+C3H10T1/2组比较,BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组MTT检测吸光度(A)值及细胞G2+S期百分比均提高(P＜0.05);而抑制Hey1表达BMP-9+C3H10T 1/2-shHey1组以上指标均降低(P＜0.05).结论 Hey1表达是BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化重要环节,同时影响细胞早期增殖.
关键词： Hey1 BMP-9 C3H10t1/2细胞 成骨分化 细胞增殖 -
重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素双基因共转染促进脂肪来源干细胞体外成骨的研究
目的 探讨重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)双基因共转染对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外成骨分化的影响.方法 取4月龄新西兰兔腹股沟脂肪组织,采用酶消化法与贴壁法分离培养ADSCs并鉴定其多向分化能力.将第3代ADSCs分为5组:A组为正常细胞,B组为空质粒转染细胞作为对照,C、D组分别采用BMP-9、EPO重组腺病毒转染细胞,E组采用BMP-9、EPO重组腺病毒共转染细胞.转染培养7d后倒置相差显微镜观察各组细胞生长变化;计算48 h时病毒转染效率,14 d荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况;14d时Western blot检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白表达.取转染培养14d的5组细胞进行成骨诱导培养,于诱导培养3、7、14d检测各组细胞ALP活性;3周时茜素红染色观察钙结节形成情况,实时荧光定量PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达.结果 转染培养7d后倒置相差显微镜下见A、B组部分细胞变为椭圆形、圆形和不规则形;C、D组可见少量长梭形细胞;E组长梭形细胞明显增多,仅见少量圆形细胞.荧光显微镜下观察BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs,转染效率为80％～93％.Western blot检测示E组BMP-9及EPO蛋白相对表达量显著高于其他组,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导培养3、7、14 d时各组细胞ALP活性明显升高,E组优于其余各组(P＜0.05);3周时茜素红染色示E组钙结节数亦显著高于其余各组(P＜0.05),实时荧光定量PCR示E组OPN和OCN基因相对表达量明显高于其他组,C、D组高于A、B组,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组腺病毒介导BMP-9及EPO基因均可转染ADSCs并稳定表达,双基因共转染后能显著促进成骨相关基因和蛋白的表达.
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人骨形成蛋白9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究
目的 探讨人骨形成蛋白9(human bone morphogenetic 9, hBMP-9)基因治疗与骨组织工程技术相结合的可行性.方法 采用阳离子脂质体介导hBMP-9基因转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),荧光显微镜观察及流式细胞学检测,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定及Von Kossa's钙结节染色;MSCs与聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide, PLGA)支架共培养,荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs在PLGA上的黏附、生长情况;将转染与未转染hBMP-9基因的MSCs分别与PLGA支架复合培养,构建组织工程化骨并回植兔肌肉内,组织植入4、8周后进行HE染色观察.结果 流式细胞仪测定质粒转染率为34.15%;转染组MSCs的ALP活性较未转染组明显增高(P<0.01),Von Kossa's钙结节染色比较转染细胞形成的钙结节明显大于未转染组;荧光显微镜及扫描电镜观察见MSCs在PLGA支架上的黏附、生长良好;异位回植术后4、8周组织HE染色见肌肉内有新生骨基质分泌,成骨面积定量分析转染组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 阳离子脂质体介导的质粒能稳定转染MSCs,BMP-9能刺激MSCs的ALP活性增强,诱导钙结节形成;BMP-9基因转染的MSCs作为一种新型的种子细胞,其与PLGA支架复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性.
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BMP-9成骨活性的实验研究
目的:评估BMP-9体外诱导成骨活性.方法:构建成功的人BMP-9的腺病毒表达载体、感染小鼠前成骨细胞C2C1 2细胞.通过测量碱性磷酸酶、骨钙素和钙结节来判定成骨活性的大小.结果:BMP-9在前成骨细胞C2C1 2细胞明显地诱导碱性磷酸酶活性.碱性磷酸酶组织化学染色分析和碱性磷酸酶化学分析结果相一致,能明显诱导骨钙素的表达及矿物质结节形成.结论:小鼠前成骨细胞C2C12细胞向成骨细胞分化中BMP-9起了重要作用.
