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铁调素干预成骨细胞（hFOB1.19）后细胞膜转铁蛋白
目的：探讨铁调素对成骨细胞铁代谢指标、骨代谢指标的影响和相互关系。方法成骨细胞（ hFOB1.19）培养3 d后，使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨细胞（hFOB1.19）的膜转铁蛋白1（ferroportin1，Fpn1）的表达；再用不同浓度的铁调素（25 noml/L，50 noml/L，100 noml/L）干预培养环境，对照组加相同体积双蒸水，干预20 h，MTT法检测细胞增殖情况；激光共聚焦扫描显微镜（ CLSM）检测成骨细胞内铁离子荧光染色后荧光强度变化情况；Von Kossa染色检测成骨细胞矿化情况；RT-PCR检测骨钙素（BGP）、I型胶原（COL1）、骨保护素（OPG）基因表达。结果1、成骨细胞存在Fpn1表达；2、铁调素对成骨细胞增殖无显著影响（ P＞0.05）；3、铁调素干预后，成骨细胞内铁离子含量增多，且与铁调素干预存剂量依赖性关系（ P＜0.05）；4、铁调素干预后，成骨细胞矿化功能增强，且与铁调素干预存剂量依赖性关系（ P＜0.05）；5、RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后，各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表达；不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同，组间密度比值比较存在统计学意义（P＜0.05），但铁调素在400 nmol/L时抑制OPG的表达（P＜0.05）。结论成骨细胞存在铁调素作用的膜转铁蛋白-1，所以铁调素干预成骨细胞培养环境后细胞内铁离子发生特异性变化，同时细胞矿化指标显著增加、细胞COL1、OPG、BGP mRNA表达含量增加；研究提示：铁调素可能通过膜转铁蛋白影响成骨细胞铁离子变化，细胞铁代谢变化可能引起细胞成骨指标上调改变。
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rhBMP-2和FGF-2对成骨细胞矿化及ENPP1、ANK、TNAP表达的影响
目的:研究重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)对成骨细胞(MC3T3-E1 Subclone 1 4)矿化及焦磷酸合成酶(ENPP1)、跨膜蛋白(ANK)和组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)表达的影响,探讨生长因子影响细胞矿化的机制.方法:将MC3T3-E1 Subclone 14细胞分成3组:成骨细胞诱导液(0S)成骨诱导培养组(对照组),OS与rhBMP-2培养组(rhBMP-2组),OS与FGF-2培养组(FGF-2组).培养12 d后进行ALP活性检测及茜素红染色,实时荧光定量PCR检测矿化相关基因ENPP1、ANK和TNAP表达的差异.结果:rhBMP-2组ALP活性以及钙化结节明显高于对照组,ENPP1、ANK和TNAP均高表达;FGF-2组ALP活性以及钙化结节明显低于对照组,ENPP1和ANK呈高表达,TNAP低表达.结论:rhBMP-2和FGF-2通过调节ENPP1 、ANK和TNAP的表达变化来影响骨的矿化.
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BMP-2/Smads信号通路在低剂量X射线促成骨细胞分化与矿化中的作用
目的 探讨骨形态蛋白2(BMP-2)/Smads信号通路在低剂量X射线促成骨细胞分化及矿化中的作用.方法 将成骨细胞分为照射组及对照组,照射组给予单次0.1 Gy X射线照射,对照组处于相同的环境下不进行X射线照射.照射后24、48、72 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,采用对硝基苯磷酸二钠法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,采用茜素红染色剂进行细胞矿化染色、十六烷基吡啶试剂进行定量;利用RT-PCR检测BMP-2、Smad1、Smad5、Smad4、成骨相关因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osterix)及骨钙素(OCN)的mRNA表达;另取成骨细胞分为0.1 Gy组、0.1 Gy拮抗剂组、control组及control拮抗剂组.0.1 Gy组、control组处理同上,两个拮抗剂组分别在0.1 Gy组及control组处理的基础上加入浓度为10μg/mL的头蛋白(NOGGIN)拮抗剂0.5 mg,照射72 h后,分别采用Western blotting及ELISA法检测上述各指标蛋白的表达,并进行各组间的比较.结果 照射组与对照组各时间成骨细胞增殖活性比较差异无统计学意义(P均>0.05).与对照组比较,照射后48 h,照射组ALP活性升高(P<0.05);照射后72 h,照射组细胞矿化定量增加(P<0.05);照射后48 h,照射组BMP-2、Smad1、Smad5、Smad4、Runx2、Osterix及OCN的mRNA表达上调(P均<0.05);照射后72 h,照射组Smad1 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05).照射后72 h,0.1 Gy组BMP-2、Smad1、Smad4、Smad5、Runx2、Osterix及OCN的蛋白相对表达量高于control组(P均<0.05);0.1 Gy拮抗剂组与control拮抗剂组上述各指标蛋白表达均下降,两组间各指标蛋白表达差异无统计学意义(P均>0.05).结论 BMP-2蛋白在低剂量X射线照射的成骨细胞中表达升高,其可通过其自分泌/旁分泌方式激活细胞Smads信号通路进而调控下游成骨基因的表达,从而促进成骨细胞分化与矿化.
关键词： 骨形态蛋白2/Smads信号通路 低剂量X射线 成骨细胞 细胞分化 细胞矿化 -
2,3,7,8-四氯二苯对二恶英染毒对大鼠成骨细胞矿化能力的影响
目的 探讨2,3,7,8-四氯二苯对二恶英(2,3,7,8-TCDD)染毒对SD大鼠成骨细胞矿化能力的影响.方法 培养新生SD大鼠颅骨来源的成骨细胞,随机分为2,3,7,8-TCDD染毒组和对照组(非染毒组).采用矿化结节计数法评价2,3,7,8-TCDD染毒对细胞矿化能力的影响.结果 2,3,7,8-TCDD染毒组矿化结节数为28.11±5.25,对照组矿化结节数为37.63±4.33,两组差异有统计学意义(P<0.01).结论 2,3,7,8-TCDD染毒使SD大鼠成骨细胞的矿化能力降低.
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大骨节病差异表达基因PAPSS2对成骨细胞矿化及碱性磷酸酶活性的影响
目的 探讨大骨节病差异表达基因PAPSS2在MC3T3-E1细胞成骨样分化过程中的表达及其对碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞矿化的影响.方法培养MC3T3-E1细胞并诱导成骨分化,观察PAPSS2在成骨细胞分化过程中的基因及蛋白表达情况;用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术或逆转录病毒转染高表达载体,分别构建PAPSS2低表达慢病毒及逆转录病毒高表达载体包装,滴度测定,验证细胞转染效率;分别转染MC3T3-E1细胞并设空白对照组,观察PAPSS2沉默或高表达后ALP活性的变化及细胞成骨矿化的影响.结果 PAPSS2在成骨细胞分化过程中mRNA及蛋白均随着矿化过程表达增加.用慢病毒介导的RNAi技术,成功降低了MC3T3-E1成骨细胞中PAPSS2的表达,使用逆转录病毒转染高表达载体显著增加PAPSS2基因的表达.PAPSS2沉默表达时,ALP活性和细胞矿化作用显著降低,高表达后其作用相反.结论 PAPSS2可调节成骨细胞ALP活性和细胞矿化作用,其异常表达可能与大骨节病骨骼病变相关.
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Wnt通路介导Caveolin-1调节成骨细胞矿化的机制研究
目的:探讨caveolin-1从Wnt通路调控小鼠成骨细胞株MC3T3-E1矿化的机制.方法:(1)在MC3T3-E1矿化期不同时间点,观察β-catenin和caveolin-1蛋白的表达变化.(2)通过检测ALP活性观察其对成骨细胞矿化作用的影响.(3)加入LiCl干预后,通过茜素红染色观察其对成骨细胞矿化的影响.结果:β-catenin和caveolin-1蛋白表达逐渐下调.ALP活性与对照组相比均无显著差异;用茜素红染色法观察发现,LiCl组钙化结节数量明显低于对照组.结论:caveolin-1可以通过Wnt/β-catenin通路调节成骨细胞矿化.
关键词： MC3T3-E1 β-catenin Caveolin-1 细胞矿化
