首页 > 文献资料
-
逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6/Smads通路表达的影响
目的:观察逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR Ⅱ、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表达的影响.方法:将200只雌性小鼠按随机数字表法分为疏肝高、低剂量组、COH组和空白对照组4组各50只.应用免疫组化和real-time PCR方法分别测定卵母细胞中BMP-6、BMPR Ⅱ、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA的表达.结果:与空白对照组比较,COH组BMP-6、BMPR Ⅱ、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达差异无统计学意义,各治疗组BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达增加,疏肝高剂量组优于低剂量组;疏肝高剂量组BMPRⅡ蛋白和mRNA表达增加.结论:逍遥丸可使BMP-6表达上调,激活其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成受体复合物,然后募集Ⅰ型受体ALK-2和ALK-6使其活化,活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化细胞内信号Smad1/5/8,然后与Smad4结合,从而启动信号传导干预卵泡发育和卵母细胞的质量.
-
补肾调经方对人卵泡壁颗粒细胞BMP/Smads表达的影响
目的 研究补肾调经方对人卵泡壁颗粒细胞Smad1(drosop hila mothers against decapentaplegic protein 1)、Smad5、Smad8及Smad4表达的影响.方法 将66例接受体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)不孕症患者按1∶2的比例分为中药加长方案控制性超排卵组(简称治疗组,23例)和长方案控制性超排卵组(简称对照组,43例).应用实时荧光定量PCR(realtime PCR)法测定取卵日成熟卵泡壁颗粒细胞Smad1、Smad5、Smad8、Smad4 mRNA的表达;应用细胞免疫荧光方法观察两组颗粒细胞Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白的表达.结果 治疗组颗粒细胞Smad1 mRNA及蛋白表达显著高于对照组(P＜0.05);两组Smad5、Smad8和Smad4 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义.结论 补肾调经方提高妊娠率、改善卵巢功能的机制可能与上调壁颗粒细胞Smad1 mRNA和蛋白的表达有关.
-
Smad5 基因缺陷导致小鼠听力重度损失
目的 观察Smad5基因敲除小鼠听功能的变化及其特点.方法 50只Smad5基因敲除的杂合子小鼠与25只野生型小鼠分成5组:2周、4周、8周、12周、24周组.分别行脑干诱发电位(ABR)检测,刺激声用click及tone burst(8 kHz,16 kHz,32 kHz).结果 Smad5基因敲除杂合子小鼠2周、4周、8周、12周、24周click刺激ABR平均听阈分别为93±2.78 dB SPL;38.7±2.58 dB SPL;64.8±3.78 dB SPL;81.5±2.48 dB SPL;95.7±4.78 dB SPL.野生型小鼠平均听阈分别为99±2.78 dB SPL;38±3.65 dB SPL;32±1.78 dB SPL;32±2.70 dB SPL;47±5.78 dB SPL.经统计学处理,除2周和4周组P＞0.05两者听阈差异无显著性外,其他时间段P＜0.01,说明基因敲除小鼠与野生型小鼠听阈差异有显著性.tone burst(8 kHz,16 kHz,32 kHz)结果与click刺激ABR听阈结果基本一致.结论 Smad5基因敲除导致小鼠随月龄增加而听力损失加重.
-
Smad5 基因敲除对小鼠前庭功能的影响
目的 观察Smad5基因敲除对小鼠前庭功能的影响,探讨Smad5基因是否为前庭功能相关基因.方法 参照Petrosini报告的动物失衡行为评分方法,观察28只实验小鼠的平衡状态.对头偏,躯干卷曲,肢体外展,强迫环形运动,头震等五项前庭失衡症状进行综合评分.20只Smad5基因缺陷小鼠(+/-)和15只野生鼠(+/+)进行颈髓硬膜表面短声诱发电位检测前庭功能.结果 动物失衡行为评分方法 进行综合评分,两组实验小鼠得分均为0分,表明两组动物在平衡功能粗测上无明显异常.颈髓硬膜表面短声诱发电位(CDM-CEP)检测Smad5(+/-)小鼠峰值潜伏期在85 dB SPL、95 dB SPL和105 dB SPL分别为6.85±0.23 ms、6.78±0.20 ms和6.70±0.43 ms.Smad5(+/+)小鼠峰值潜伏期在85 dB SPL、95 dB SPL和105 dB SPL分别为6.15±0.23 ms、6.12±0.20 ms和6.37±0.43 ms.结论 Smad5基因敲除导致CDM-CEP的潜伏期延长,表明Smad5基因敲除对小鼠的前庭功能有一定影响.
-
Smad5 基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察
目的 观察Smad5基因敲除杂合(3月组2只小鼠4只耳蜗)子小鼠内耳形态学超微结构变化.方法 野生型动物组:1个月组4只小鼠5只耳蜗,2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗;杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗,2个月组2只小鼠4只耳蜗,3个月组3只小鼠6只耳蜗.按常规方法制成标本作扫描电镜观察.结果 Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察:1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合,未见外毛细胞缺失,内毛细胞未见明显地病理变化.2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失,有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主,而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主,有的以片状缺失为主,有的则以散在性缺失为主.3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失,有外毛细胞缺失的部位多,以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主,第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主,有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失.野生型动物组扫描电镜观察:1个月组4只小鼠5只耳蜗,2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化,3月组有少量的外毛细胞缺失.结论 野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化.杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重.
-
Smad5基因敲除小鼠听生理和耳蜗形态实验观察
目的观察Smad5基因敲除小鼠(Smad5+/-)听生理和耳蜗形态改变,探讨Smad5基因是否为一种新的听功能相关基因.方法双盲对照法对Smad5(+/-)和Smad5(+/+)小鼠进行听性脑干诱发电位(ABRs)的听阈检测和耳蜗毛细胞形态观察及毛细胞计数.结果ABR听阈Smad5(+/-)小鼠24周时为90.63±17.65dB(SPL),Smad5(+/+)小鼠为63±19.94dB(SPL),二者差异显著(P<0.01).耳蜗基底膜铺片显示Smad5(+/-)小鼠内、外毛细胞缺失,其中在底回处尤其突出,Smad5(+/+)小鼠内、外毛细胞少量缺失.Smad5(+/-)与Smad5(+/+)小鼠外毛细胞计数差异有显著性意义(P<0.01),而内毛细胞计数差异无显著意义(P>0.05).结论Smad5基因敲除导致小鼠中、重度听力下降,耳蜗基底膜毛细胞缺失,以外毛细胞为主.Smad5基因敲除导致毛细胞缺失是Smad5(+/-)小鼠听力损失的原因之一.推测Smad5基因可能是听功能相关基因.
-
Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位
目的了解Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位.方法应用RT-PCR检测Smad5基因的表达,用原位杂交法检测耳蜗中Smad5 mRNA的表达部位,用免疫组织化学方法确定Smad5蛋白在耳蜗中的定位.结果Smad5基因在小鼠耳蜗中有高表达,表达部位在毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等.结论Smad5在耳蜗中存在,是耳蜗中众多蛋白中的一种.它可能在耳蜗的形成、毛细胞的分化过程中起着重要的作用.
-
Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响
目的 研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响.方法 培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导.结果 病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%.与A组比较,BMP-2诱导24 h显著提高了B组Smurf1 mRNA 水平 (P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01).C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和 Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响.结论 在BMP-2 诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA 干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高.
关键词： Smad6 RNA干扰 骨髓间充质干细胞 Smad5 Smad泛素化调节因子-1 -
miR-155通过抑制SMAD5调控成骨细胞骨分化
背景：诱导成骨细胞分化为骨细胞是组织工程中的研究热点，但分化过程中的调节机制尚未完全阐明。MicroRNA是一类内源性小RNA分子，可通过与靶基因mRNA的3’端非编码区结合在转录后水平调控基因表达。研究证实，microRNA在骨细胞分化过程中起到重要的调节作用。
目的：研究miR-155对成骨细胞骨分化的调节作用以及作用机制。
方法：取小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞，加入小鼠骨形态发生蛋白2(200μg/L)进行成骨诱导，并与诱导第1，3，7，14天，通过qRT-PCR检测miR-155 mRNA的表达。并将MC3T3-E1细胞分为对照组、诱导组、miR-155组和miR-155 inhibitor组，对照组用α-MEM培养基培养，诱导组在培养基中加入骨形态发生蛋白2进行成骨诱导，miR-155组和miR-155 inhibitor组在成骨诱导之前分别转染miR-155和miR-155拮抗剂，诱导2周。
结果与结论：①茜素红染色及碱性磷酸酶活性测定：经骨形态发生蛋白2诱导后，miR-155 mRNA表达呈时间依赖性下调。诱导组MC3T3-E1细胞茜素红着色强度、碱性磷酸酶活性和mRNA表达也显著高于对照组(P<0.01)；miR-155组茜素红着色强度明显低于诱导组，碱性磷酸酶活性和mRNA也明显低于对照组(P<0.01)，而miR-155 inhibitor组则呈反向变化(P<0.05)；②荧光报告基因检测和western blot检测：miR-155可与SMAD5 mRNA 3’非编码区结合，并明显降低MC3T3-E1细胞中SMAD5蛋白和mRNA表达(P<0.01)。结果表明，miR-155可通过负性调控SMAD5表达，抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。 -
密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠骨髓Smad1、Smad5、Smad6基因表达的影响
目的 研究密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠股骨骨髓中Smad1、Smad5、Smad6基因表达的影响.方法 取12月龄自然衰老SD雄性大鼠100只随机分为2组,每组50只.自鼠龄12月龄始,分别给予生理盐水、密骨胶囊灌胃,在鼠龄14、16、18、20、22月龄时,每组各取10只大鼠,取右股骨,DEXA检测BMD,取左股骨骨髓,RT-PCR半定量检测Smad1、Smad5、Smad6基因表达.结果 在14 ～ 22月龄阶段,密骨胶囊组与空白对照组相比较,密骨胶囊可维持股骨BMD (P=0.797),上调Smad1、Smad5 mRNA表达水平(P＜0.01),下调Smad6 mRNA表达水平(P＜0.01).结论 密骨胶囊可以上调股骨骨髓中Smad1、Smad5基因表达水平,下调Smad6基因表达水平,这可能是其促骨形成、修复骨损伤作用的分子机制之一.
-
miR-424在人脂肪来源间充质干细胞成骨分化中的调控作用
目的 探讨miR-424在人脂肪来源间充质干细胞(hASC)成骨分化中的表达及miR-424对hASC体外成骨分化的生物学作用.方法 qPCR检测miR-424在hASC成骨分化不同阶段的表达水平.通过慢病毒颗粒在体外感染hASC,使miR-424过表达或抑制其表达,进行Western blotting、细胞免疫荧光试验及碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色试验,研究miR-424对骨形态发生蛋白2(BMP-2)及成骨诱导液诱导hASC成骨分化过程的影响.预测miR-424的靶基因,并利用qPCR及Western blotting验证.结果 qPCR结果显示miR-424在hASC的表达量随着成骨诱导时间延长逐渐下降(P＜0.05).在BMP-2诱导下,过表达组的碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)蛋白水平均下降,而抑制组的表达增加(P＜0.05).细胞免疫荧光显示,过表达miR-424的细胞骨唾液酸蛋白(BSP)阳性率显著下降(P＜0.05).ALP和ARS染色显示,过表达组ALP活性降低,钙盐沉积下降,而抑制组ALP活性升高,矿化能力增强.过表达miR-424能降低hASC中Smad5的mRNA和蛋白水平,而抑制miR-424则使其水平升高(P＜0.05).结论 miR-424在hASC成骨分化中表达下调,其在hASC体外成骨分化过程中起抑制作用.
关键词： 人脂肪来源间充质干细胞 miR-424 Smad5 成骨分化 -
Smad1、Smad5在肾阳虚不育大鼠睾丸中表达的研究
目的:观察Smad1、Smad5在腺嘌呤诱导的肾阳虚不育大鼠睾丸中的表达,探讨肾阳虚不育的病理机制,为防治男性不育提供可靠的实验依据.方法:60 d雄性SD大鼠48只,随机分为6组(肾阳虚7、14、21 d组;正常对照7、14、21 d组),每组8只.以腺嘌呤300 mg/kg给大鼠灌胃,诱导肾阳虚不育大鼠模型,于灌胃第7、14、21 d,用免疫组化SABC法测定Smad1、Smad5在其睾丸中的表达.结果:Smad1表达见于所有正常对照组及模型组大鼠睾丸各级生精细胞的胞质内,支持细胞及间质细胞未见表达;灌胃第7、14 d与正常对照组相比差异无显著性(P＞0.05),第21 d的表达较正常对照组及第7、14 d明显减弱(P＜0.05).Smad5表达见于正常对照组及腺嘌呤灌胃第7 d大鼠睾丸的初级精母细胞及精原细胞的胞核内,两组比较差异无显著性(P＞0.05),其余各级生精细胞、支持细胞及间质细胞均未见表达;灌胃第14、21 d大鼠睾丸中未见Smad5表达.结论:肾阳虚大鼠睾丸中Smad1表达的减弱及Smad5的无表达,可能是导致其不育的病理机制之一.
-
MiR-155调控Smad5促进糖尿病肾病肾脏纤维化作用
目的 探讨MiR-155调控Smad5在糖尿病肾病(DN)肾脏纤维化的作用.方法 应用荧光定量PCR及原位杂交检测miR-155在DN肾组织中的表达.采用生物信息学预测miR-155的靶基因,并通过Western Blot及检测双荧光素酶报告基因活性进行验证.采用Western Blot检测DN系膜细胞增殖及系膜基质相关标志蛋白的表达.结果 (1)MiR-155在DN肾组织及高糖刺激的肾实质细胞中均表达升高.(2)MiR-155靶向调控Smad5基因表达.(3)MiR-155通过下调Smad5表达促进系膜细胞增殖及细胞外基质增加.结论 MiR-155通过调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化,为深入认识DN的发病机制提供了依据.
-
微小RNA-135b调控Smad5在糖尿病肾病发病中的作用研究
目的 探讨微小RNA-135b(miR-135b)在糖尿病肾病(DN)发病中的作用及可能机制. 方法 应用荧光定量PCR及原位杂交检测miR-135b在DN肾组织中的表达.采用生物信息学预测miR-135b的靶基因,并通过蛋白免疫印迹法及检测双荧光素酶报告基因活性进行验证.同时行蛋白免疫印迹法检测DN系膜细胞增殖及系膜基质相关标志蛋白的表达.结果 实时定量PCR显示,miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织升高(P<0.05).原位杂交显示,miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织增强,且其表达主要位于肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核中.人肾小管上皮细胞HMC及人系膜细胞HK-2在高糖培养24 h时均能上调miR-135b的表达,48 h升高更显著,与同时点正常对照培养的HMC及HK-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05).人源和鼠源的Smad5 3`-非翻译区与miR-135b种子序列的8个碱基UUUCGGUA完全互补.miR-135b 模拟物可下调Smad5的蛋白表达水平,而miR-135b 抑制物对Smad5的蛋白表达无影响.将Smad5 3`-非翻译区野生型和突变型质粒分别转染入HMC及HK-2,并同时转染miR-135b模拟物,发现miR-135b 模拟物能抑制Smad5 3`-非翻译区野生型荧光素酶活性,但对Smad5 3`-非翻译区突变体的荧光素酶活性无影响.miR-135b促进系膜细胞增殖及系膜基质增加 HMC细胞转染miR-135b模拟物,可有效下调其靶蛋白Smad5的表达,同时上调增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(Cyclin D1)表达,且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白p21表达降低(P均<0.05),但转染miR-135b抑制物对PCNA、Cyclin D1、p21的表达无影响(P均>0.05).结论 MiR-135b通过调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化.
关键词： 微小核糖核酸-135b 糖尿病肾病 Smad5 肾脏纤维化 -
miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究
目的 探讨miR-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCsC3H10T1/2细胞的成骨分化.方法 构建Smad5 3'-UTR-荧光素酶报告载体(pmiR-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察miR-93-5p对Smad5 3'-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为miR-93-5p的靶基因.将miR-93-5p mimics(M组)与miR-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组miR-93-5p mimics阴性对照(MC组)与miR-93-5p inhibitor阴性对照(InC组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)及Westemblot检测各组细胞Smad5在mRNA及蛋白水平的相对表达量;14d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解miR-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应.结果 双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-93-5p能与Smad5 mRNA3'-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(p＜0.05).qRT-PCR检测示,M组及In组Smad5的mRNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及InC组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较InC组表达量上调.茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较InC组钙盐沉积明显增多.结论 Smad5是miR-93-5p的靶基因,miR-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化.
-
人牙乳头细胞内Smad5蛋白表达的免疫组化研究
目的：观察Smad5蛋白在体外原代培养的人牙乳头细胞内的表达及其在转化生长因子-β超家族信号转导中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞，分别以骨形成蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2)和转化生长因子- β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)刺激，免疫组化检测Smad5的表达，图像分析仪半定量。结果：人牙乳头细胞（空白对照组）胞浆内可见Smad5阳性表达，胞核内未见阳性表达；BMP-2实验组胞核内Smad5强阳性表达，胞浆内为弱阳性表达； TGF-β1实验组细胞胞浆Smad5阳性，胞核未见表达。结论：人牙乳头细胞内存在Smad5的表达，Smad5能转导BMP-2信号至核内发挥作用，但不能转导TGF-β1信号，提示BMP-2在牙齿发育过程中信号传递可能是通过Smad5的信号转导途径实现的。
-
Smad1，4，5在人牙髓组织中的表达分析
目的：观察骨形态发生蛋白(BMP)下游信 号转导分子Smad1，4，5在正常、龋坏和炎症人牙髓组织中的表达及表达差异，探讨Smad1， 4，5在牙髓损伤 修复过程中的作用。方法：制备正常、龋坏和炎症人牙髓组织标本 ，采用免疫组化方法检测Smad1，4，5在各类牙髓组织中的表达。结果：Smad1，4，5在正常 和龋坏牙髓的成牙本质细胞层呈强阳性表达，在下方的富细胞区及牙髓中心部位为阳性或弱 阳 性表达，炎症牙髓浸润的炎细胞中Smad1，4，5呈强阳性表达。其中Smad4在各类牙髓中表达 强，Smad1次之，Smad5弱。结论：观察到S mad1，4，5在正常、龋坏和炎症人牙髓组织中的表达及其差异，提示Smad1，4，5作为BMP的 胞内信号转导分子，可能参与牙髓组织的自身修复过程。
