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等轴牵张应变对骨间充质干细胞成软骨分化早期的影响
目的:观察平面诱导培养条件下,等轴周期性牵张应变刺激对小鼠BMSCs成软骨分化早期的影响,探讨等轴周期性牵张应变刺激在软骨分化过程中早期的作用机制.方法:选取4周龄KM小鼠16只,雌雄不限,平均体重19.5 g(17～21g),提取骨髓间充质干细胞,体外培养至第3代,种植于BioFlex细胞培养板,根据实验设计分6组:空白组,普通培养液培养8d,不给予等轴周期性牵张应变刺激;对照组,成软骨诱导分化培养液培养8d,不给予等轴周期性牵张应变刺激;实验组,实验组又分4组,均使用成软骨诱导分化培养液培养8d,期间分别给与1、3、5、7d等轴周期性牵张应变刺激.于培养第8天收集各组细胞,采用RT-PCR分析SOX9、Col-Ⅱ及ROCK1 mRNA的相对表达量,采用CCK-8法对各组细胞行增殖率检测,使用糖胺聚糖Elisa试剂盒检测上清液糖胺聚糖含量,行番红0及阿利新蓝染色观察细胞外基质(ECM)变化,正态计量资料采用均数±标准偏差表示,对照组与空白组比较采用配对样本t检验,实验组与对照组比较采用单因素方差分析.结果:(1)培养8d后,对比对照组,实验组中随加载时间延长,SOX9、Col-ⅡmRNA相对表达量呈逐渐增高趋势(P＜0.05),而ROCK1 mRNA相对表达量呈下降趋势(P＜0.05);对比空白组,实验组及对照组的ROCK1mRNA相对表达量均增加(P＜0.05).(2)随加载时间延长,实验组出现先降后升趋势,但是对比空白组及对照组均增高,对照组较空白组明显下降.(3)通过对后1次换掉的培养基做糖胺聚糖浓度的Elisa检测,实验组内糖胺多糖的分泌量逐渐增加,加载7d组含量变化较其他组差异有统计学意义(P＜0.05);与空白组比较,实验组及对照组糖胺多糖的分泌量明显增加(P＜0.05).(4)番红O及阿尔新兰染色显示,实验组有成软骨分化趋势,形状随时间加载均逐渐变长,均较对照组明显;实验组内PCM、Col-Ⅱ、GAG含量随力学刺激天数增加逐渐增多均较对照组明显.结论:平面诱导培养条件下,在BMSCs成软骨分化早期,等轴周期性牵张应变刺激可以促进骨髓间充质干细胞增殖以及向软骨细胞分化,等轴周期性牵张应变刺激可能是通过抑制Rho/ROCK1信号通路来促进成软骨分化.
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右归饮含药血清对骨髓间充质干细胞成软骨分化的促进作用及其microRNA表达谱分析
目的:观察右归饮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的效应,分析此过程中的microRNA表达谱变化,探讨右归饮含药血清促进BMSCs成软骨分化的分子机制.方法:体外培养大鼠BMSCs,经TGF-β1基因慢病毒转染后48h给开始右归饮含药血清干预,培养7d,采用Ⅱ型胶原免疫组化染色、甲苯胺蓝染色、Real time PCR方法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达.采用microRNA芯片技术和生物信息学方法,分析差异microRNA表达谱变化,预测关键microRNA、信号通路及靶基因.结果:TGF-β 1基因成功转染BMSCs并能稳定表达.转染组和右归饮组的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,空载组染色均为阴性;与空载组比较,转染组和右归饮组Ⅱ型胶原mRNA、聚集蛋白聚糖mRNA的表达上调(P＜0.01);与转染组比较,右归饮组Ⅱ型胶原mRNA、聚集蛋白聚糖mRNA的表达上调(P＜0.01).右归饮组与转染组相比,17个microRNA个显著上调,2个microRNA显著下调(P＜0.05,|fold change | ≥0.585).miR-24-3p、MAPK信号通路及MAPK13、MAPK14、TRAF6、MAP3K7基因被预测为关键microRNA、信号通路及靶基因.结论:右归饮含药血清能较好地促进BMSCs成软骨分化,右归饮通过上调miR-24-3p阻断MAPK信号通路可能发挥了重要作用.
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GDF-5和Dex通过Wnt/β-catenin信号通路促进rBMSCs体外成软骨分化
目的 利用生长分化因子(GDF-5)联合地塞米松(Dex)诱导大鼠BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt/β-catenin 信号通路在其中的作用.方法 用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞随机分成6组:BMSCs组、BMSCs+ Dex组、BMSCs+ GDF-5组、BMSCs+ GDF-5+ Dex组、BMSCs+GDF-5+Dex+ SB216763组和BMSCs+GDF-5+ Dex+XAV-939组.连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian blue染色检测细胞的蛋白聚糖,RT-PCR检测成软骨分化相关基因aggrecan、Col2、Sox9、Col1,Wnt/β-catenin信号通路相关基因Dvl1、Gsk3β、β-catenin mRNA表达,Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达.结果 与BMSCs组相比,BMSCs+GDF-5+ Dex组能够使诱导的细胞蛋白聚糖分泌明显增加;Aggrecan、C012、Sox9基因表达明显增加(P＜0.05);Ⅱ型胶原蛋白表达增加(P＜0.05);β-catenin mRNA及蛋白表达水平也增加(P＜0.05).与BMSCs+ GDF-5+ Dex组相比,添加SB216763组蛋白聚糖,Ⅱ型胶原基因和蛋白表达增加(P＜0.05);相反,添加XAV-939组相应的成软骨分化基因及蛋白表达下降(P＜0.05).结论 GDF-5联合地塞米松(Dex)可诱导大鼠BMSCs成软骨分化,Wnt/β-cate-nin信号通路可能在其中发挥促进作用.
关键词： Wnt/β-catenin BMSCs 成软骨分化 GDF-5 -
间充质干细胞成软骨分化诱导相关细胞因子的研究进展
软骨的破坏、缺损是包括骨关节炎（osteoarthri-tis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。近年来，随着间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的发现和研究的深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性[1-5]，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。除了从骨髓中获取该细胞，目前已经从人体多种组织分离、获得了此类细胞，如脂肪、关节液、骨膜、胎盘组织、肝、脾、胰腺等[6-8]。有文献报道，MSCs不具有免疫原性[9]，甚至可能通过调节免疫细胞功能，起到免疫抑制作用[10-12]。此外，各种成软骨分化刺激因子的发现、应用及各种3D支架的探索，使得MSCs结合各种技术在软骨修复的临床应用中显示出极大的可能价值。
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不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞成软骨能力调节作用的研究
目的：研究分化前阶段不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞（ SMSCs）成软骨能力的调节作用，并探究其分子调节机制。方法将分化前阶段SMSCs分组置于含有不同浓度葡萄糖的培养基中进行增殖培养：一组采用低浓度（1.0 g／L）葡萄糖培养SMSCs（LGMSMCs）；另一组采用高浓度（4.5 g／L）葡萄糖培养SMSCs（ HGMSMCs）。增殖培养7 d后，将两组SMSCs同时进行成软骨诱导分化，通过检测软骨标志基因的表达水平来评价两组SMSCs成软骨能力的大小；通过分析转化生长因子-β（ TGF-β）和蛋白激酶-C（ PKC）信号通路系统来研究其分子调节机制；设置平行实验，在高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G?6983进一步研究TGF-β和PKC信号通路系统。不同浓度的葡萄糖培养基中分化前DNA总量，分化前、分化阶段的SMCSs成软骨相关基因的表达比较采用成组t检验。结果 SMSCs培养第21天，HGMSMCs组的蛋白聚糖（AGN）、Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）及Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达明显少于LGMSMCs组的（t＝－3.69，P＜0.05；t＝－77.57，P＜0.01；t＝－34.42， P＜0.01）；在SMSCs分化前阶段， GMSMCs 组的 TGF-βⅡ型受体（ TGF β-RⅡ）的表达明显高于LGMSMCs组的（t＝4.5，P＜0.01）；在SMSCs分化阶段，GMSMCs组的PKC磷酸化水平及TGF-βⅡ型受体（TGFβ-RⅡ）的表达明显低于LGMSMCs组的（t＝－5.84，P＜0.01；t＝－4.79，P＜0.01）。另外，在平行实验中，SMSCs分化前阶段，往高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G?6983较未加入抑制剂更能上调SMSCs在分化阶段TGFβ-RⅡ的表达水平（t＝－1.03，P＜0.05）。结论在SMSCs分化前阶段，低糖培养可以增加SMSCs成软骨能力；其分子机制是葡萄糖对分化前阶段TGF-β和PKC信号通路进行调节，进而调节分化阶段SMSCs成软骨能力。
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猪脂肪间充质干细胞的原代培养及诱导鉴定
目的：原代培养猪脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cell，ADMSC），探索其适宜培养温度并对其进行诱导鉴定。方法采用胶原酶消化法原代分离培养猪脂肪间充质干细胞，用WST-1法比较猪ADMSC在37℃和38℃条件下的生长曲线，向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化ADMSC，鉴定其多能性。结果用胶原酶消化法可以从猪颈部脂肪组织中分离培养出脂肪间充质干细胞，贴壁生长，P2代以后形态均一，稳定增殖，约5天可传代，在一定条件诱导下可以向成骨、成脂或成软骨方向分化，适宜在5%CO2、38℃、饱和湿度条件下培养。结论原代培养的猪脂肪间充质干细胞分离方便、增殖速度快、状态稳定，具有多向分化潜能，是可靠的供体细胞来源。
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TGF-β2诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的研究
目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGFβ2)诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的作用.方法 取胎龄13.5天的小鼠分离培养腭突细胞,并分别加入不同的细胞因子进行成软骨诱导培养.A组为空白对照组,B组为TGFBR1(转化生长因子受体1)抑制剂-SD208组,C组为加入TGF-β2组,D组SD208+TGF-β2组.通过比较蛋白聚糖、蛋白聚糖半定量,以及软骨标志基因的表达水平,评价各组细胞因子诱导腭突细胞成软骨能力大小及作用.结果 在TGF-β2作用下腭突细胞向软骨细胞分化,TGF-β2组蛋白聚糖及软骨相关基因表达量高,显著高于A、B、D组(P<0.01).B、D组蛋白聚糖及软骨相关基因的表达量较A组明显降低(P<001).结论 腭突细胞在TGF-β2诱导下具有成软骨分化能力.
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基于间充质干细胞的组织工程软骨表型稳定性的研究进展
关节软骨属于透明软骨,由于其缺乏血管神经,自我修复能力差,目前临床上针对其损伤或病变的临床治疗方案并不能达到理想的修复效果.组织工程技术为关节软骨再生提供了新的方法,间充质干细胞(mes-enchymal stem cell,MSC)作为重要的种子细胞之一,但目前仍存在由MSC分化而来的软骨组织表型不稳定,出现肥大、骨化的问题,制约了其应用.本文对基于MSC的组织工程软骨的组织表型稳定性研究进展进行综述.
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人转化生长因子β2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞定向分化的实验研究
目的:探讨脂肪问充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞和基因增强的组织工程的可行性.方法:取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,通过脂质体介导,将hTGFβ2基因转染到体外培养的脂肪间充质干细胞中,采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测目的基因与软骨特异性蛋白--Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况.结果:从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴向脂肪细胞分化;hTGFβ2基因转入脂肪间充质干细胞能获得瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成.结论:从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的问充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,可自发或经诱导后分化为脂肪细胞;pcDNA3.1(+)/hTGFβ2真核表达载体成功转染脂肪问充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化.
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中药诱导骨髓间充质干细胞成软骨及成骨分化的研究进展
骨髓间充质干细胞(BMSCs)不仅具有强大的自我更新能力、多向分化潜能,还兼具低免疫原性及归巢能力,是骨及软骨组织工程中理想的种子细胞.目前,诱导BMSCs分化的细胞因子由于价格昂贵和安全性问题而无法广泛应用于临床实践中.研究表明中药及其有效成分可诱导BMSCs分化,具有与细胞因子类似的生理活性.文章旨在对中药诱导BMSCs成软骨及成骨分化的研究进展进行综述,以期为骨科疾病的防治研究提供参考.
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人牙龈成纤维细胞和牙周膜韧带细胞多向分化潜能的比较
目的 体外培养人牙周膜韧带细胞(HPDLCs)和人牙龈成纤维细胞(HGFs),对比两者成骨、成软骨以及成脂的多向分化潜能的差异.方法 运用酶消化结合组织块法体外培养HPDLCs和HGFs,选择生长状态良好的3~4代HPDLCs和HGFs,进行成骨、成软骨、成脂诱导,未分化诱导的细胞作为对照组.分别用茜素红染色、油红O染色以及阿利新蓝染色分别检测两种细胞的成骨、成软骨及成脂分化能力.半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HPDLCs和HGFs中相关标志基因骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Col 1)、runt相关转录因子2(RUNX2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、X型胶原蛋白(Col 10)mRNA的表达.结果 成骨诱导两种细胞培养至28 d时,细胞周围均有红染钙结节形成,HPDLCs形成的钙结节明显多于HGFs;成软骨诱导两种细胞14 d时均可见胞质蓝染的细胞,HGFs较HPDLCs明显;成脂诱导两种细胞21 d时,可见红色脂肪滴形成,HPDLCs形成的脂肪颗粒明显少于HGFs.HGFs和HPDLCs分化培养7 d和14 d后,均有OCN、Col 1、RUNX2、PPARγ2和Col 10的表达,在14 d时的表达均高于 7 d;HPDLCs 中 OCN、Col 1、RUNX2 的表达高于 HGFs,PPARγ2、Col 10 的表达低于 HGFs(均 P<0.05).结论 HPDLCs的成骨能力较HGFs强,成软骨和成脂能力较HGFs弱.
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体外诱导人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的实验研究
目的：探索人牙龈成纤维细胞（hGFs）是否具有多向分化潜能，为组织工程学提供新的细胞来源。方法经志愿者知情同意后收集健康牙龈组织，组织块法培养hGFs。取第3代hGFs进行成骨、成软骨和成脂诱导，未分化诱导的细胞为对照组。分别用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色、阿利新蓝染色、油红O染色检测细胞成骨、成软骨和成脂能力。实时定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞中成骨分化标志基因ALP、runt相关转录因子2（Runx2）、成软骨分化标志基因聚集蛋白聚糖（AGR）和成脂分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的表达。结果成骨诱导组培养至7 d时ALP染色可见大量的蓝紫色沉淀，28 d时细胞周围有大量红染的钙结节沉积，而对照组无钙结节,培养至14 d细胞中ALP和Runx2表达明显高于对照组（P<0.01）。14 d时成软骨诱导组阿利新蓝阳性，成脂诱导组可见红色的脂肪滴，而对照组2种染色为阴性，AGR、PPARγ2表达均明显高于对照组（P<0.01）。结论 hGFs具有成骨、成软骨和成脂分化的多向分化潜能。
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共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化
背景：基于干细胞的组织工程技术作为治疗骨关节损伤修复的有效手段，具有广泛的应用前景。研究表明miRNA在调控干细胞向软骨分化过程中具有重要的作用。
目的：探讨共感染慢病毒介导的反义miR-221-3p/222-3p(microRNA-221-3p，microRNA-222-3p)对人骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用，为临床软骨损伤修复提供新的策略。
方法：利用miRNA基因芯片技术筛选转化生长因子β3诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中不同阶段表达差异的miRNA，并利用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)验证；构建慢病毒人反义miR-221-3p/222-3p载体(Lv-miR-221-3p-inhibition ， Lv-miR-222-3p-inhibition)并共转染人骨髓间充质干细胞，空载体组(Lv-GFP)以及未转染组作为对照。利用CCK-8法检测沉默miR-221-3p/222-3p 6 d后细胞的增殖情况；通过番红O染色法、免疫组织化学方法以及RT-PCR验证各组软骨诱导21 d后软骨分化相关标志物的表达。
结果与结论：构建的Lv-miRNA-221-3p/222-3p inhibition共转染人骨髓间充质干细胞，成功沉默了细胞中的miR-221-3p/222-3p表达水平；miRNA基因芯片与RT-qPCR验证结果显示miR-221-3p/222-3p在软骨分化后期表达明显降低；转染组与未转染组以及空载体组相比：①细胞增殖明显受到抑制。②番红O染色以及免疫组织化学显示软骨分化特征标志物硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原表达增强。③RT-qPCR也证实硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原的mRNA表达也明显上调。结果显示沉默人骨髓间充质干细胞miRNA-221-3p/222-3p，抑制了细胞增殖并促进了成软骨分化。 -
基底膜基质/壳聚糖诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化
背景：课题组前期研究发现基底膜基质能够定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨方向分化，但其力学性能与实际应用有较大差距，还需要进一步研究。目的：制备兼具适宜力学性能和优异生物相容性的壳聚糖/基底膜基质水凝胶支架用于软骨修复。方法：以京尼平为交联剂，将壳聚糖溶液与基底膜基质按2︰1，1︰1，1︰3比例混合制成水凝胶，接种大鼠骨髓间充质干细胞，培养14 d。经材料力学测试、细胞增殖、活细胞染色、酶联免疫吸附测试以及阿尔新蓝染色等方法评价材料诱导细胞成软骨分化能力。结果与结论：在基底膜基质内添加壳聚糖后，材料力学性能从0.48 kPa上升到1.78 kPa。标志性蛋白分泌结果显示，纯壳聚糖组早期诱导成软骨活性高于其他组，但后期诱导能力减弱，而含基底膜基质各组在后期能够保持较好的诱导活性，其中壳聚糖/基底膜基质=1︰1组材料具有一定的力学强度，且Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达量在14 d较其他组高。结果表明实验制备的壳聚糖/基底膜基质水凝胶具有良好的力学性能，并能够促进骨髓间充质干细胞向软骨方向分化，可用于软骨组织工程研究。
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人骨骼肌来源不同表面标志物间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能
背景:骼肌来源的间充质干细胞,在骨形态发生蛋白4等因子的调节下具有多向分化潜能,但具体细胞亚群的分化情况尚不十分明确.目的:观察人骨骼肌来源的不同表面标志物的间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能.方法:应用流式细胞分选技术,分选出具有不同细胞表面标志物的人骨骼肌干细胞亚群,根据CD56及CD34/CD144的表达差异,将细胞分成CD56+,CD56+CD34+CD144+,CD34+CD144+及未分选组共4组,对比不同细胞亚群组在骨形态发生蛋白4成骨诱导或骨形态发生蛋白4+转化生长因子β3成软骨诱导后的差异.通过碱性磷酸酶染色后碱性磷酸酶阳性细胞的百分比评估细胞骨代谢情况.将各亚群细胞进行3D培养和细胞因子处理后,通过硝酸银染色评估其成骨分化程度,通过阿尔新蓝染色评价成软骨分化程度.结果与结论:①细胞骨代谢:经骨形态发生蛋白4处理后,4组细胞的碱性磷酸酶阳性细胞的百分比差异无显著性意义(P>0.05);②细胞分化:不同表面标记物的4组细胞成骨及成软骨分化有明显差异,在相同成骨培养条件下,CD56+组成骨能力强;相同成软骨培养条件下,CD56+,CD56+CD34+CD144+组呈阿尔新蓝染色阳性,CD56+CD34+CD144+组的染色更深且区域更大;③结果证实,成骨与成软骨潜能与不同的人骨骼肌间充质干细胞类型有关.人骨骼肌来源的间充质干细胞CD56+亚群和成骨潜能有密切关系.同时CD56+CD34+CD144+亚群分化能力更强,具有更强的成软骨潜能.
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骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化
背景：目前临床对于慢性腱病缺乏有效的治疗手段，原因在于其发病机制至今尚未阐明。
目的：研究体外骨形态发生蛋白2对胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型髌腱来源肌腱干细胞的成骨、成软骨分化的作用。
方法：从大鼠慢性腱病模型的髌腱中分离培养出原代肌腱干细胞，传代培养至第3代细胞，行成骨、成脂、成软骨诱导分化鉴定其干细胞的特性。将肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，用重组人骨形态发生蛋白2干预。7 d后分别行茜素红染色，并行茜素红染色定量分析。将肌腱干细胞体外三维微球培养后分为2组，诱导组用重组人骨形态发生蛋白2干预，对照组不进行干预。21 d后三维微球行苏木精-伊红染色，阿利辛蓝染色以及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。
结果与结论：慢性腱病大鼠来源原代肌腱干细胞体外培养呈克隆样集落生长，传代后细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞，具有成纤维细胞样的特征。肌腱干细胞(P3)成脂诱导10 d，油红O染色阳性；成骨诱导7 d，茜素红染色阳性；成软骨诱导14 d，苏木精-伊红染色阳性可见软骨样细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。单层培养的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2诱导7 d茜素红染色阳性，对照组为阴性，茜素红染色定量检测显示差异有显著性意义。重组人骨形态发生蛋白2诱导肌腱干细胞21 d，苏木精-伊红染色可见软骨样细胞形成、阿利辛蓝染色可见细胞内糖胺多糖沉积、Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。可见体外重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病来源的肌腱干细胞成骨、成软骨分化。这为进一步研究慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。 -
骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的形态学变化
背景:骨髓间充质干细胞在向软骨细胞分化过程中可形成聚合体,但是该形态学特点是否可代表骨髓间充质干细胞已经成软骨分化尚无研究报道.目的:观察骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中聚合体的形成和成软骨分化情况.方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第6代时备用.对照组用无血清LG-DMEM培养基培养14d,诱导组用含转化生长因子β3的成软骨完全诱导培养基培养14d,倒置显微镜观察诱导过程中细胞形态变化;免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、qRT-PCR检测成软骨特异指标Ⅱ型胶原、蛋白多糖和成软骨转录因子SOX9的基因表达及蛋白合成情况.结果与结论:①与对照组相比,诱导组骨髓间充质干细胞在第3天失去典型的成纤维形态,第7天开始形成成簇的单层聚合体,第14天形成直径更大的多层聚合体;②聚合体的免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色均阳性,而聚合体外的单个细胞无特异染色;③qRT-PCR亦证实诱导组有成软骨特异基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9表达;④上述研究结果提示骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中聚合体的形成可作为成软骨分化的一种形态学检测指标.
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环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力
背景:目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段.目的:构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况.方法:应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比.转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量.对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响.结果与结论:慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上.RT-PCR和Western blot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制.环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响.
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人类软骨糖蛋白39诱导关节软骨祖母细胞的成软骨分化
背景：有研究表明人类软骨糖蛋白39与骨关节软骨的退变与修复具有一定的关系，但其具体的作用机制并不十分明确。目的：观察人类软骨糖蛋白39对成人膝关节软骨祖母细胞成软骨诱导分化的影响。方法：取成人关节软骨，消化分离培养关节软骨祖母细胞；流式细胞仪检测传代细胞中能够表达 CD105、CD166的细胞量并进行分离提纯。将分离的软骨祖母细胞采用单层培养法培养，传代培养至第2代后向分离培养所得的软骨祖母细胞中，分别经过含人类软骨糖蛋白39成软骨培养基及普通成软骨诱导培养基的诱导培养14 d后，通过免疫组织化学染色观察经诱导后细胞中Ⅱ型胶原的表达及通过大体组织学观察评估软骨的形成。结果与结论：关节软骨组织中可以分离出能够表达CD105、CD166的关节软骨祖母细胞，软骨祖母细胞经过诱导分化后逐渐聚集并形成结节，经诱导后Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性，且经人类软骨糖蛋白39诱导细胞形成的结节更大，Ⅱ型胶原表达更多。结果表明，成人关节软骨中能够分离培养出具有成软骨分化能力的干细胞系细胞即软骨祖母细胞，且能够被定向诱导分化为软骨细胞，人类软骨糖蛋白39对其分化过程具有一定的促进作用。
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骨软骨前体细胞分离鉴定及转化生长因子β3对其成软骨分化的影响
背景:关节软骨中存在着前软骨干细胞,可能成为软骨组织工程潜在的种子细胞,转化生长因子β3对前软骨干细胞的增殖及成软骨分化具有正向调节作用.目的:分析转化生长因子β3对骨软骨前体细胞成软骨的分化作用.方法:分离筛选出晚期骨关节炎患者软骨组织 CD146+软骨细胞并鉴定.培养 CD146+软骨细胞团块分为4组:为普通培养基组,转化生长因子β3-诱导组,转化生长因子β3+诱导组(含2.5 μg/L重组人转化生长因子β3)和转化生长因子β3++诱导组(含10 μg/L重组人转化生长因子β3).培养4周后行组织块Ⅱ型胶原、Aggrecan免疫组织化学及相关基因实时荧光定量PCR检测.结果与结论:①成软骨诱导培养时,转化生长因子β3++诱导组所形成软骨块＞转化生长因子β3+诱导组＞转化生长因子β3-诱导组;②免疫组织化学结果显示,转化生长因子β3++诱导组Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达明显高于转化生长因子β3+诱导组(P＜ 0.05),转化生长因子β3+诱导组表达明显高于转化生长因子β3-诱导组(P＜ 0.05);③实时荧光定量PCR检测显示,转化生长因子β3++诱导组Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达明显强于转化生长因子β3+诱导组(P＜ 0.05),转化生长因子β3+诱导组2指标表达明显强于转化生长因子β3-诱导组(P＜ 0.05);转化生长因子β3++诱导组和转化生长因子β3+诱导组性别决定区Y框蛋白-9的表达均明显强于转化生长因子β3-诱导组(P＜ 0.05);④结果表明,晚期骨关节炎患者残余关节软骨中存在着具有干细胞特性的骨软骨前体细胞;转化生长因子β3具有较强促骨软骨前体细胞成软骨分化的能力,其有可能成为软骨组织工程中理想的细胞因子.
