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GDF-5联合地塞米松诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化
目的 探讨GDF-5联合地塞米松诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核样细胞分化潜能及其表型的改变.方法 用全骨髓贴壁法及序贯酶消化法分别分离培养大鼠BMSCs和髓核细胞(NPCs),均取P3代细胞分为1)对照组,2)BMSCs+ Dex组3)BMSCs+ GDF-5组4)BMSCs+ Dex+ GDF-5组(联合诱导组)5)NPCs组.诱导培养21 d,镜下观察细胞形态及密度变化,阿辛蓝染色检测蛋白多糖,RT-PCR检测COL1、ACAN、SOX9及COL2和髓核细胞阳性基因KRT19、PAX1和FOXF1的表达.Western blot检测COL2及COL1蛋白表达.结果 BMSCs形态呈长梭型、漩涡样生长;NPCs呈球形、岛状生长的特点;诱导后BMSCs向类圆形、三角形转变,细胞体积缩小,胞质颜色与对照组相比逐渐加深;蛋白多糖分泌增加,以联合诱导效果佳.ACAN、SOX9、COL2基因的相对表达量逐渐增高,ACAN/COL2的比例呈递增趋势,COL1的表达呈递减趋势.NPCs阳性基因KRT19、PAX1、FOXF1与对照组相比(P＜0.05).含GDF-5的诱导组COL2蛋白表达高于对照组(P＜0.05),而联合诱导组COL1蛋白的表达少.结论 GDF-5可以诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化,且地塞米松能起到显著促进作用,为BMSCs移植治疗椎间盘退变提供了理论依据.
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GDF-5和Dex通过Wnt/β-catenin信号通路促进rBMSCs体外成软骨分化
目的 利用生长分化因子(GDF-5)联合地塞米松(Dex)诱导大鼠BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt/β-catenin 信号通路在其中的作用.方法 用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞随机分成6组:BMSCs组、BMSCs+ Dex组、BMSCs+ GDF-5组、BMSCs+ GDF-5+ Dex组、BMSCs+GDF-5+Dex+ SB216763组和BMSCs+GDF-5+ Dex+XAV-939组.连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian blue染色检测细胞的蛋白聚糖,RT-PCR检测成软骨分化相关基因aggrecan、Col2、Sox9、Col1,Wnt/β-catenin信号通路相关基因Dvl1、Gsk3β、β-catenin mRNA表达,Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达.结果 与BMSCs组相比,BMSCs+GDF-5+ Dex组能够使诱导的细胞蛋白聚糖分泌明显增加;Aggrecan、C012、Sox9基因表达明显增加(P＜0.05);Ⅱ型胶原蛋白表达增加(P＜0.05);β-catenin mRNA及蛋白表达水平也增加(P＜0.05).与BMSCs+ GDF-5+ Dex组相比,添加SB216763组蛋白聚糖,Ⅱ型胶原基因和蛋白表达增加(P＜0.05);相反,添加XAV-939组相应的成软骨分化基因及蛋白表达下降(P＜0.05).结论 GDF-5联合地塞米松(Dex)可诱导大鼠BMSCs成软骨分化,Wnt/β-cate-nin信号通路可能在其中发挥促进作用.
关键词： Wnt/β-catenin BMSCs 成软骨分化 GDF-5 -
生长分化因子-5(GDF-5)的研究进展
GDF-5是骨形态发生蛋白家族中较新的成员,在促进肢体发育,调节细胞分化,骨与软骨发育等方面具有重要的作用.本文从其对肢体发育、软骨、骨等的影响方面进行综述.
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SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化
背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应.目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果.方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组.转染后第14 天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的mRNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达.结果与结论:共转染组SOX-9 mRNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P < 0.05);共转染组GDF-5 mRNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染.
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自体脂肪干细胞、壳聚糖/胶原蛋白支架材料及GDF-5复合物移植修复兔软骨缺损
背景:GDF-5可诱导人脂肪干细胞分化为软骨样细胞,壳聚糖/胶原蛋白支架在软骨组织损伤修复中应用广泛.目的:利用兔的自体脂肪干细胞复合壳聚糖/胶原蛋白支架材料加入GDF-5修复兔关节软骨缺损,观察其修复效果.方法:取日本大耳兔皮下脂肪组织提取脂肪干细胞体外培养、纯化、扩增,并BrdU体外标记,应用紫外线交联法以1:3比例构建壳聚糖/胶原蛋白复合支架载体,将标记后的兔脂肪干细胞种植到支架载体上共同培养形成复合物,以手术方式造成兔膝关节软骨直径为5 mm,深3 mm的圆柱形缺损,建立膝关节软骨缺损模型兔,随机分为4组,复合物组:脂肪干细胞+壳聚糖/胶原蛋白支架+GDF-5复合物植入干预;支架组:单纯植入壳聚糖/胶原蛋白支架;脂肪干细胞组:单纯植入脂肪干细胞;假手术组:单纯钻孔不作处理.各组干预4,8,12周时取材,行组织学检测、软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及BrdU免疫荧光染色.结果与结论:①术后12周,与其他3组相比,复合物组圆柱型缺损处完全被与周围正常软骨相同的乳白色透明样物质填充修复,软骨缺损区域由分化一致的透明软骨所替代修复,Wakitani评分低(P<0.01);②Ⅱ型胶原免疫组化染色及BrdU免疫荧光染色:复合物组与术后4,8,12周免疫组化染色可见修复区组织Ⅱ型胶原染色胞浆内呈淡黄色阳性表达,修复区新生组织可见BrdU绿色荧光表达;③结果证实,自体脂肪干细胞+壳聚糖/胶原蛋白支架+GDF-5复合物移植修复兔膝关节软骨缺损效果较好.
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生长分化因子5对骨关节系统的作用
生长分化因子5(GDF-5)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一员,与骨形成蛋白亚家族密切相关.GDF-5与关节腔、关节囊、关节软骨的形成均有密切的联系,而GDF-5的突变则会引起骨关节系统发育的异常.除此之外,GDF-5与肌腱及韧带的形成相关.本文就GDF-5在骨关节系统形成过程中的作用作一综述.
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缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体软骨分化的影响
[目的]研究缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体外软骨分化的影响.[方法]体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,以生长分化因子-5(GDF-5)(100 ng/ml)和1-庚醇(2.5 μmol/L)干预培养后,MTT法测定1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响,RT-PCR和免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达,Western blotting检测Cx43蛋白的表达,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖.[结果]MTT结果显示2.5 μmol/L浓度1-庚醇对小鼠MSCs的增殖不产生影响,对细胞没有毒性抑制作用;RT-PCR和免疫细胞化学显示1-庚醇能够抑制Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达;Alcian染色结果显示1-庚醇抑制分化细胞分泌蛋白多糖基质;Western blotting结果表明1-庚醇对Cx43蛋白的表达没有作用.[结论]GDF-5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化,Cx43蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯在GDF-5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用.
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GDF-5在小鼠肢体骨骼发育中的表达及对肢芽细胞影响的研究
目的:初步观察并探讨生长分化因子-5(GDF-5)在小鼠肢体发育过程中的表达及对肢芽细胞软骨分化的影响.方法:RT-PCR法检测小鼠肢体发育过程中GDF-5表达的变化情况;MTT法测定不同浓度GDF-5对体外微团培养肢芽细胞增殖率的影响;Alcian染色在倒置相差显微镜下观察不同浓度GDF-5对肢芽细胞软骨分化的影响,探讨GDF-5影响骨骼系统发育的机理.结果:RT-PCR结果提示GDF-5在胚胎发育的第12、13d高表达,骨骼系统基本形成之后在孕14、15d表达渐下降稳定于一较低水平;不同浓度GDF-5对肢芽细胞增殖率影响不同,50ng/ml浓度组促肢芽细胞增殖作用强;Alcian染色结果显示GDF-5促进肢芽细胞软骨分化的作用呈剂量依赖效应,以120ng/ml组软骨分化快,软骨结节体积大,100ng/ml组软骨结节的数量多.结论:GDF-5在肢体发育的不同阶段表达水平不同,在骨骼系统形成早期及关节系统形成阶段表达强,主要通过影响肢芽细胞增殖及软骨分化而发挥作用.
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pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达
目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达.方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3.1(+)载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3.1(+)/GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达.结果:重组质粒双酶切图谱显示有5.4 kbp和1.6kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT-PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性.结论:本实验成功构建pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础.
