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兔髓核细胞原代培养及独活寄生汤对Fas介导的凋亡通路的影响
目的:研究兔髓核细胞的培养条件及生物学特性,并探讨独活寄生汤对体外培养兔髓核细胞凋亡的影响.方法:无菌环境下分离兔腰椎髓核组织,酶消化法消化,用DMEM/F12(1∶1)培养液培养.通过Ⅱ型胶原及集聚蛋白聚糖免疫组织化学检测进行细胞鉴定.髓核细胞传至第二代时开始药物干预.根据独活寄生汤药液不同浓度(100、200、400μg/mL)进行分组,0μ g/mL为空白对照组.药物干预72h后,收集髓核细胞.RT-PCR法检测Fas、FasL、Bcl-2、Bid、Bax、Caspase-8、Caspase-3 mRNA表达情况.结果:髓核细胞Ⅱ型胶原和集聚蛋白聚糖免疫组化染色为阳性.与空白对照组比较,独活寄生汤干预后能够下调Fas、Fasl、Bax、Bid、Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达(P＜0.05),上调Bcl-2 mRNA的表达(P＜0.05).结论:体外环境下单层培养、酶消化法成功培养了兔髓核细胞.独活寄生汤通过抑制Fas介导的Ⅰ型和Ⅱ型凋亡通路的激活,从而抑制髓核细胞凋亡.
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内毒素诱导退变人椎间盘髓核细胞凋亡
目的 观察内毒素(LPS)刺激退变人椎间盘髓核细胞前后,核因子kappB(NF-κB)的活化与细胞凋亡的相互关系.方法 体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,采用CCK-8法测定LPS在不同浓度下(100、200、500和1 000 μg/mL)对髓核细胞增殖影响,并筛选合适的刺激浓度;设立空白对照组,单纯LPS(500 μg/mL)刺激组,NF-κB 抑制剂(BAY11-7082)+LPS(500 μg/mL)刺激组,以Hochest33258染色以及AnnexinV-PI双标法检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、PARP、NF-κB 结合蛋白P65以及磷酸化P-P65的表达.结果 CCK-8实验结果 显示当LPS浓度为500 μg/mL能明显降低细胞的活力.与空白对照组相比,单纯LPS刺激组细胞凋亡率上升(P<0.05),P-P65表达明显增加,其凋亡蛋白活化型caspase-3和PARP降解产物表达也增高(P<0.05).而与单纯LPS刺激组相比,NF-κB 抑制剂+LPS刺激组细胞凋亡率下降(P<0.05),P-P65表达明显降低,其凋亡蛋白活化型caspase-3和PARP降解产物表达也降低(P<0.05).结论 NF-κB信号通路可能与椎间盘退变时髓核细胞凋亡的发生密切相关,值得进一步研究.
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人椎间盘髓核细胞突起的形态学特征
目的 探讨成人腰椎间盘髓核细胞突起的形态学特征.方法 取8例成人腰椎间盘髓核组织标本(Thompson Ⅰ～Ⅱ),分别行冰冻切片和电镜切片,同时进行髓核细胞的分离和单层培养,利用光镜、激光扫描共焦显微镜和透射电镜,从组织、细胞和超微结构水平观察细胞突起的形态学特征.结果 所有的髓核细胞均具有明显的突起结构,相邻的细胞突起间可见缝隙连接.在体状态下均呈类圆形的髓核细胞进行离体培养时却呈现梭形和类圆形两种不同的形态,梭形细胞与类圆形细胞的比例约为2.3∶1.梭形细胞的突起顺着细胞体长轴发出,未见二级突起.类圆形细胞的突起从细胞体四周发出,突起呈树枝状,可见多级突起.结论 突起是椎间盘髓核细胞的形态学特征之一,对突起功能的深入研究将有助于加深对椎间盘退变病理机制的认识.
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腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘髓核细胞的表达
目的观察以腺病毒为载体的外源性治疗基因Ad/CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞后的表达.方法采用本实验室构建的腺病毒载体基因Ad/CMV-hTGF-β1 20μl(6×106 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内;手术后不同时间分别取出椎间盘,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物测定;用VIDAS图像分析系统进行半定量观察.结果免疫组织化学染色显示注射Ad/CMV-hTGF-β1椎间盘,4 d组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒;1周组即显示强阳性染色,阳性表达持续至12周组.实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或弱阳性反应.结论椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源性基因转染;腺病毒载体基因Ad/CMV-hTGF-β1转染兔椎间盘髓核细胞后能在相当长时间内表达TGF-β1蛋白.
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幼年与成年兔椎间盘髓核细胞的形态学差异及其意义
目的探讨幼年与成年兔髓核细胞的形态学差异.方法利用激光共聚焦显微镜和透射电镜,对幼年和成年兔的髓核组织进行组织细胞水平和超微结构的观察.结果幼年兔的髓核细胞呈圆形,簇状分布,其直径为(266±167)μm,细胞簇的密度为每个高倍(×40)视野(14.9±4.3)个,细胞内含有大量空泡状的包含体.成年兔的髓核细胞呈圆形或类圆形,细胞簇小或呈单个散在分布,细胞簇的直径为(94±42)μm,细胞簇密度为每个高倍(×40)视野(8.0±2.4)个细胞,其中包含体数目少且不含大的包含体.结论幼年与成年兔的髓核细胞具有明显的形态结构差异.椎间盘成年期发生的这种形态结构上的变化可能是随年龄增加而椎间盘生物学功能逐渐降低的原因之一.
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香芹酚通过抗氧化应激和抗细胞凋亡作用保护大鼠髓核细胞
目的 探讨香芹酚(CAR)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠髓核细胞损伤模型细胞增殖率、氧化应激反应以及细胞凋亡的影响及相关机制.方法 H2O2预处理构建大鼠髓核细胞损伤模型,实验分为5组,正常对照组,模型组,实验组.实验组又分为香芹酚10μmol/L、香芹酚25μmol/L、香芹酚50μmol/L,正常对照组和模型组只给与等量PBS溶液.体外培养24 h后利用CCK-8法检测细胞增殖率,ELISA法检测各组细胞氧化应激因子丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT),利用Western blot法检测凋亡蛋白Bax和Bcl-2蛋白表达.结果 CCK8结果显示,H2O2预处理的髓核细胞较正常对照组增殖率显著下降,而经过香芹酚处理后,各组细胞增殖率较模型组有所提高,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性;ELISA法结果显示,香芹酚能显著下调H2O2预处理的髓核细胞氧化应激因子表达,与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性;Western blot法显示,香芹酚治疗后能显著上调Bc-2表达,抑制Bax蛋白表达(P<0.05),并呈剂量依赖性.结论 香芹酚可通过抑制髓核细胞氧化应激反应以及抑制细胞凋亡从而对髓核细胞损伤发挥保护作用,其作用呈剂量依赖性.
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髓核组织工程学研究进展
椎间盘退化是临床上一个重大的问题,椎间盘退化起自于椎间盘细胞以及髓核细胞外基质的变化.近年来,随着对椎间盘退变的分子学基础研究的进展,人们提出用生物对策来修复和恢复退变的椎间盘,其中一种很有希望的方法是应用组织工程的方法修复退变的椎间盘,恢复椎间盘组织的功能.作者就种子细胞、细胞支架和生长因子方面髓核组织工程学的研究进展进行综述.
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白细胞介素-1β对髓核细胞基质金属蛋白酶-3,7,9,13 mRNA表达的影响
目的 探讨白细胞介素-1β(IL-1β)对人椎间盘髓核细胞表达基质金属蛋白酶-3,7,9,13的作用.方法 分离人椎间盘髓核细胞进行单层培养并利用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定,而后分别用10 ng/ml和50 ng/ml重组人IL-1β刺激体外培养的髓核细胞,RT-PCR检测基质金属蛋白酶-3,7,13的表达,定量PCR检测基质金属蛋白酶-9的表达.结果 通过10 ng/ml和50 ng/ml重组人IL-1β的刺激,基质金属蛋白酶-3,7,9,13表达均较对照组高(P<0.05);基质金属蛋白酶-9,13表达随IL-1β浓度升高而升高(P<0.05);在相同浓度的IL-1β(10 ng/ml)下,与对照组相比基质金属蛋白酶-7,13表达升高分别约为10倍和38倍,较基质金属蛋白酶-3,9升高明显(P<0.05).结论 IL-1β可以促进人椎间盘髓核细胞表达基质金属蛋白酶-3,7,9,13,而且以基质金属蛋白酶-7,13明显,提示IL-1β的存在加速了椎间盘基质分解,且其所诱导的分解可能主要是通过基质金属蛋白酶-7,13起作用.
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肝细胞生长因子对体外培养的人退变髓核细胞生物学活性影响
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的人退变髓核细胞的生物学作用.方法 收集人退变髓核组织标本,分离培养髓核细胞;免疫组化染色观察HGF受体在髓核细胞中表达;设立不同浓度HGF组(0 ng/ml,5 ng/ml,50 ng/ml,500 ng/ml),采用MTT法测细胞生长曲线,筛选HGF佳作用浓度;选取第3代髓核细胞,实验分HGF组、HGF+胰岛素样生长因子(IGF)组、IGF组、对照组,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达:流式细胞术测定细胞增殖的周期.结果 免疫组化显示髓核细胞表达HGF受体;MTF法提示不同浓度HGF对体外培养的人退变髓核细胞均有明显的促增殖作用,与对照组相比差异均有统计学意义,50 ng/ml是实验中HGF的佳作用浓度;HGF、HGF+IGF、IGF刺激后髓核细胞进入增殖期比例增加,同时促进髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达量增加,其中HGF+IGF效果更为显著.结论 人退变髓核细胞存在HGF受体;HGF对体外培养的人退变的髓核细胞有促增殖作用,可以促进细胞外基质表达;HGF与IGF联合作用效果优于两者单独作用.
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影响髓核细胞表达水通道蛋白1相关因素的实验研究
目的 通过观察不同细胞外环境下,体外培养的兔髓核细胞调节水通道蛋白1(AQP-1)表达的变化,探讨AQP-1 可能对髓核细胞在适应外环境变化时发挥的作用.方法 体外原代培养成年兔腰椎髓核细胞成功后,在不同渗透压和氧分压条件下继续培养细胞,观察细胞的活性,并通过免疫组化和实时定量PCR 观察关键蛋白aggrecan,2 型胶原和AQP-1 的表达变化.结果 体外培养髓核细胞4 ～5 周后可以传代,传代细胞繁殖增快,在不同的培养条件下,细胞活性无明显差异,在基因水平关键蛋白aggrecan 和2 型胶原表达均下降.在低渗透压条件下,细胞显著下调AQP-1 表达,在低氧分压条件下,细胞显著上调AQP-1 表达,在低氧分压和低渗透压条件下,AQP-1 表达呈上升趋势.结论 不同外环境对髓核细胞的影响不同,髓核细胞对AQP-1 的表达有差异,提示AQP-1 可能易化髓核细胞适应外环境变化.
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低强度脉冲超声波对体外培养人退变腰椎间盘细胞的作用
目的 探讨低强度脉冲超声波(LIPUS)对体外培养人退变腰椎间盘细胞的作用.方法 体外培养人退变髓核细胞,台盼蓝染色法测定活细胞率.将每份髓核细胞样本分为对照组和LIPUS组.应用LIPUS每天作用20 min,作用后第0、2、4、8天,采用免疫组化法测定Ⅱ型胶原水平,采用酶联免疫吸附法检测聚集蛋白聚糖(aggrecan)水平.结果 体外培养人退变髓核细胞的活细胞率为90%～95%.LIPUS干预后第2、4、8天,LIPUS组Ⅱ型胶原的合成和aggrecan含量均较相应时间点对照组显著增加(P＜0.05).结论 LIPUS能够通过促进人退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖防治椎间盘退变.
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慢病毒介导生存素基因转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞生物学效应的比较
目的 研究慢病毒介导生存素基因(Lentivirus-Survivin)对早、晚期反分化人椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法 应用组织块法分离培养人椎间盘髓核细胞,采用绿色荧光素标记法检测慢病毒载体对其转染效率.通过免疫荧光法、MTT法、Western-Blot法和Antonopulos法检测比较Lentivirus-Survivin对反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞Survivin 表达、细胞活性、Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响.结果 反分化早期髓核细胞中存在Survivin的表达,而反分化晚期髓核细胞中则极少表达.Lentivirus-Survivin可高效转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞,并促进细胞中Survivin表达.对于反分化早期椎间盘髓核细胞,Lentivirus-Survivin可增强髓核细胞活性以及细胞外基质(Ⅱ型胶原和蛋白多糖)的合成;对于反分化晚期髓核细胞,其反而抑制细胞活性以及细胞外基质的合成.结论 Lentivirus-Survivin适用于反分化早期椎间盘髓核细胞,而不适用于反分化晚期的髓核细胞.
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CDMP-1诱导骨髓间充质干细胞分化成髓核细胞的实验研究
目的 探讨软骨衍生形态发生蛋白-1(CDMP-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核细胞分化,并检测其诱导的细胞是否具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能.方法 BMSCs采用0 ng/ml(对照组)以及10 ng/ml(观察组)的CDMP-1处理,将正常椎间盘髓核细胞作为阳性对照组.BMSCs诱导后采用PCR检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因水平表达,用Western Blot法检测Ⅱ型胶原蛋白水平的表达.采用阿尔辛蓝染色及定量比较蛋白多糖含量的变化.结果 PCR检测结果发现,观察组和对照组中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原均有增加,而阳性对照组中Ⅱ型胶原明显比观察组更少.基因水平检测结果发现,CDMP-1诱导BMSCs分化后Ⅱ型胶原基因表达比正常髓核细胞还高.观察组中Ⅱ型胶原的蛋白水平表达明显比阳性对照组和对照组细胞更高,对照组中Ⅱ型胶原蛋白水平表达几乎很少.阿尔辛蓝染色结果发现,观察组蛋白多糖含量稍高于阳性对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05);阳性对照组与观察组蛋白多糖含量均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CDMP-1能够诱导BMSCs向髓核细胞分化,具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能.
关键词： 软骨衍生形态发生蛋白-1 骨髓间充质干细胞 髓核细胞 Ⅱ型胶原 蛋白多糖 -
细胞生物学治疗方法在椎间盘退行性病变方面的研究
在近几年几种以细胞为基础的治疗来刺激椎间盘再生过程得到倡议：造血干细胞（ haematopoietic stem cells HSC ）、胎儿脊柱细胞（ fetal spine cells ）、永生性髓核细胞系（ immor-talized NP－cell lines ）、自体椎间盘软骨细胞（ autologous IVD chondrocytes ）、胚胎干细胞（ embryonic stem cells SC ），诱导性多能行胚胎干细胞（ induced pluripotent SC ）、嗅觉胚胎干细胞（ olfactory SC ）和来源于骨髓或脐带血的细胞的MSC已经被证明具有促进椎间盘再生／修复的潜力。髓核祖细胞（从髓核中单独分离得到的大约具有1％的比率）可分化为软骨形成细胞和神经源性细胞系，表明具有促进椎间盘再生的潜力［1］。除了椎间盘再生之外，祖细胞可能起到保护性作用。在调节椎间盘的炎症方面，在体外共同培养的纤维环细胞与巨噬细胞中研究发现家兔髓核祖细胞被证明可降低促炎性细胞：IL－6、IL－8以及iNOS的表达水平［99］。对于椎间盘再生而言，MSC为主要的具有吸引力的替代细胞类型，部分是因为它们能够做为自体移植物。在犬类动物模型的研究中，MSCs能够增加Ⅱ型胶原的表达同时降低椎间盘内细胞凋亡的数量。在家兔模型中， MSCs能够在椎间盘中保持24周左右。但是移植性MSCs的数量为关键。犬类动物模型中，每个椎间盘含有的MSCs细胞数量非常关键，每个椎间盘中会有106个MSCs为理想，因为105个MSCs可导致细胞的生存能力下降，而107个MSCs可诱导细胞凋亡。除了MSCs的多种分化能力之外其与免疫调节相关的作用已经得到证明。 MSCs在炎症中的作用是建立在它们作为细胞因子释放工厂直接与损伤细胞相互作用的积极作用［2］。在一项小鼠的肺损伤模型中研究中，MSCs被发现可分泌IL－1Ra或在小鼠梗死模型中产生有能力的抗炎症蛋白：TNF－α刺激基因／蛋白6（ TNF－αstimulated gene／protein 6 TSG－6）。有趣的是在全身性应用MSCs之后，TSG－6也被鉴定为大鼠角膜损伤模型中的关键因子。将MSCs移植入小猪、兔、犬椎间盘后，在FaS配体（其他的免疫特免位点发现的一种蛋白质）表达重新恢复，表明MSCs可能分化为细胞表达FasL，也可能刺激新生的髓核细胞产生这种FasL，这样会促成在退变性椎间盘中免疫特免位点的恢复。
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退变腰椎间盘细胞经体外转基因培养生物学活性的实验研究
目的 构建转化生长因子(transforming growth factor,TGF) -β3的真核表达载体pEGFP-TGF-β3转染椎间盘髓核细胞,研究转基因TGF-β3对退变髓核细胞生物学特性的影响.方法 通过手术方法制作椎间盘突变模型,从而获取原代退变椎间盘髓核细胞,通过脂质体将真核载体pEGFP-TGF-β3导入髓核细胞,然后对细胞的形态和增殖活性(MTT法)进行观察,应用Westen Blot检测TGF-β3在髓核细胞的表达含量,应用免疫细胞化学方法检测转染后髓核细胞的Ⅱ型胶原的表达.结果 髓核细胞转染后,细胞活性增强,TGF-β3表达增加,并随着时间的延长而增加.Ⅱ型胶原表达增加.结论 TGF-β3转染退变髓核细胞可起到维持髓核细胞表型,并在细胞传代后仍发挥调节作用.TGF-β3确实具有促进髓核细胞增殖和Ⅱ型胶原合成的能力,从而有可能延缓甚至逆转椎间盘退变.
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骨髓间充质干细胞在低氧共培养条件下对髓核细胞保护作用的实验研究
背景:对于骨髓间充质干细胞(BMSCs)与髓核(NP)细胞共培养的研究主要集中在不同条件下的干细胞向NP细胞表型的分化.一些研究表明,在动物试验中干细胞影响退变的NP细胞.少有研究人BMSCs对NP细胞的影响,特别是在低氧条件下.目的:建立同一患者的BMSCs和NP细胞的共培养模型,探讨在低氧环境下BMSCs对NP细胞的生物学影响.方法:分离培养患者的NP细胞和BMSCs.并将其分为两组.A组为NP细胞单独培养组,B组为NP细胞与BMSCs共培养组.两组细胞均连续培养14 d.通过光学显微镜观察两组细胞形态及数量,用流式细胞仪和扫描电子显微镜(SEM)观察细胞死亡.用细胞计数kit-8试剂盒(CCK8)评估细胞增殖,进一步采用实时/逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞外基质(ECM)和NP细胞特殊表型的标记的表达.结果:培养14 d后,光学显微镜下观察,单独培养组可见NP细胞贴壁和延伸,NP细胞的数量比培养前多.在共培养组,NP细胞形态是纺锤形,贴壁、延伸比单培养组好,NP细胞的数量远远超过培养前,并且多于单独培养组.CCK8检测表明,培养14 d后,与单独培养组相比,共培养组的NP细胞更多(P<0.05),单独培养组细胞凋亡率高于共培养组(P<0.05).在低氧和与BMSCs共同培养条件下,蛋白多糖(AGG)、胶原Ⅱ(COL2),SOX-9,角蛋白19(KRT19),碳酸酐酶Ⅻ(CA12)和低氧诱导因子(HIF)表达增加.RT-PCR检测表明这些基因和蛋白的合成、分泌在与BMSCs共培养的NP细胞组中明显高于NP细胞单独培养组.结论:在体外更接近体内条件的低氧直接共同培养条件下,BMSCs可能会通过调节ECM和调节基因来保护或激活退化的NP细胞.为BMSCs治疗椎间盘退变提供了一个重要的新思路.
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IL-1β 作用下功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶对大鼠髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原代谢影响的实验研究
目的 观察修饰有骨形态发生蛋白质7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS在低浓度炎症因子白介素-1β(inter leukin-1β,IL-1β)(10 pg/ml)持续作用下对大鼠髓核细胞蛋白多糖和II型胶原代谢的影响.方法 体外分离培养SD大鼠髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs),取第3代NPCs分别在无BMP-7功能片段的RADA16-I或修饰有BMP-7功能片段的RADKPS中培养,试验共分4组:A组(无IL-1β 干预的RADA16-I组)、B组(有IL-1β 干预的RADA16-I组)、C组(有IL-1β 干预的RADKPS组)和D组(无IL-1β 干预的RADKPS组).分别在培养的第3天、第6天及第9天通过RT-PCR和ELISA检测髓核细胞蛋白多糖和II型胶原在RNA和蛋白水平的表达量.结果 RT-PCR和ELISA结果表明在第3天和第6天时C组蛋白多糖和II型胶原的表达水平均明显高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05),但到第9天时两组之间的差异无统计学意义(P>0.05);B组蛋白多糖和II型胶原的表达水平在第3天、第6天及第9天时均低于A组,但差异均无统计学意义(P>0.05);在第3天时C组蛋白多糖和II型胶原的表达水平低于D组,差异无统计学意义(P>0.05),在第6天和第9天时,C组中两者的表达量均明显低于D组,且差异均有统计学意义(P<0.05).结论 髓核细胞经BMP-7功能片段刺激后对IL-1β 抑制其蛋白多糖和II型胶原合成的作用更为敏感,但低浓度IL-1β(10 pg/ml)不能完全抵消功能化自组装多肽纳米纤维水凝RADKPS中BMP-7功能片段对大鼠NPCs蛋白多糖和II型胶原合成的促进作用.本研究表明RADKPS在体外条件下有一定的抗IL-1β 作用,所以即使在炎症因子IL-1β 的存在下,RADKPS仍能促进髓核细胞蛋白多糖和II型胶原的合成.
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相关生长因子和细胞因子对延缓和逆转椎间盘变性的研究进展
椎间盘变性(disc degeneration,DD)是骨科常见病和多发病,常并发腰痛和椎间盘突出.随着年龄增长而反复发作并逐渐加重.可导致劳动能力丧失.椎间盘是一个较为复杂的生物整体,具有非常独特的解剖和生理特征,大体分为纤维环(annulus fibrosus,AF),髓核(nucleus pulposus,NP)和终板(end plates,EP).它呈现低细胞密度,包括纤维环细胞、髓核细胞以及可能存在的骨祖细胞.引起椎间盘退变的因素包括机械负荷、遗传因素和营养作用等,这些因素通过影响椎间盘细胞的活力及生物合成能力,再加上应力作用,促使了椎间盘退变的发生和发展.目前没有特别有效的治疗方法来阻止变性和渐进过程,因此寻找一种更符合生理、能够使组织再生的方法才能从根本上解决椎间盘退变的问题.近年来关于对各种调节分子包括生长因子、细胞因子等在椎间盘内的产生和相互作用,以及他们在椎间盘变性中的作用的研究日趋增多.近年新发现的骨生长蛋白-1应用于临床来促进变性的椎间盘组织恢复的可能性研究也日见报道.本文对相关的生长因子和细胞因子对延缓和逆转椎间盘变性的相关研究进行系统综述.
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内源性硫化氢合成酶在人突出腰椎间盘髓核中的表达和意义
目的 研究内源性硫化氢合成酶在突出椎间盘髓核组织中的表达情况及其与缺氧相关的细胞因子HIF-1a的表达以及髓核细胞凋亡之间的关系.方法 选取2009年2月至2009年8月间北京大学第一医院骨科因为腰椎间盘突出症而行后路手术切除的椎间盘髓核组织标本共40例,其中男性16例,女性24例;年龄20～81岁,平均49.3岁.根据腰椎MRI和术中所见,将其分为包含组(后纵韧带完整)和非包含组(后纵韧带破裂),每组病例20例,同时选取先天性脊柱侧弯手术切除椎间盘髓核组织标本5例作为对照组.通过免疫组化研究CBS、CSE及HIF-1α在不同椎间盘突出类型髓核细胞中表达的情况;通过TUNEL染色研究不同椎间盘突出类型中髓核细胞凋亡的情况;分别比较CBS、CSE、HIF-1α免疫组化阳性率和TUNEL染色阳性率在对照组、包含型和非包含型之间的差异;进一步研究髓核细胞中CBS、CSE与HIF-1α表达的相关性以及与细胞凋亡的相关性.结果 CBS在椎间盘髓核组织中的表达情况:非包含组阳性率为51.3%±3.9%,包含组中阳性率为38.2%±5.5%,对照组中阳性率为19.8%±4.9% (P<0.01).CSE在椎间盘髓核组织中的表达情况:非包含组阳性率为51.5%±4.7%,包含组中阳性率为31.0%±5.3%,对照组中阳性率为18.3%±2.4% (P<0.01).HIF-1α在椎间盘髓核组织中的表达情况:非包含组阳性率为54.2%±4.8%,包含组中阳性率为29.3%±3.5%,对照组中阳性率为13.9%±4.0% (P<0.01).椎间盘髓核组织TUNEL染色情况:非包含组阳性率为21.4%±4.2%,包含组中阳性率为16.2%±6.1%,对照组中阳性率为7.6%±1.9% (P<0.01).经Person相关分析后,CBS和HIF-1α的表达正相关,r=0.849,(P<0.001);CSE和HIF-1α的表达正相关,r=0.915 (P<0.001);CBS的表达和TUNEL阳性表达正相关,r=0.671,(P<.001);CSE的表达和TUNEL阳性表达正相关,r=0.801 (P<0.001).结论 腰椎突出椎间盘组织中表达内源性H2S合成酶CBS和CSE,并且其表达与突出类型、HIF-1表达和髓核细胞凋亡相关,提示内源性H2S的合成和功能可能与缺氧相关,并在椎间盘细胞的凋亡过程中起到调节作用.
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红景天苷通过 JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡
目的 观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系.方法 通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10 μg/mL、30 μg/mL 和50 μg/mL的红景天苷培养液.后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组. RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和 p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡.结果 与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6 水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调.与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β 和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低.红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平.结论 红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡.
