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塞来昔布诱导人椎间盘细胞表达神经生长因子
目的 研究环氧化酶2抑制剂塞来昔布以及前列腺素E2(PGE2)对神经生长因子(NGF)表达的影响.方法 分离培养人椎间盘(IVD)细胞,用不同浓度的塞来昔布预处理30 min后,加入10 ng/mL IL-1β作用6h.RT-PCR和ELISA分别检测NGF mRNA和蛋白的表达,ELISA检测PGE2的分泌.同时加入外源性PGE2以及其受体(EPs1 ~4)激动剂,观察其对NGF产生的影响.结果 IL-1β作用3h即可以一定的时间依赖性诱导IVD细胞表达NGFmRNA.塞来昔布处理后能使NGF mRNA水平进一步增加1.8倍.IL-1β处理后,PGE2含量达(5.46±0.64) ng/mL.10 mmol/L塞来昔布能将其降低至(1.07±0.04)ng/mL(P <0.05).IVD细胞经100 μmol/L PGE2处理后,IL-1β诱导的NGF降低了59% (P <0.05).此外,采用EP2和EP4受体激动剂处理IVD细胞后,也得到了类似的结果,而EP1和EP3激动剂处理对NGF产生无明显影响.结论 塞来昔布能促进IVD细胞表达NGF,其机制可能与抑制PGE2的分泌有关.
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椎间盘退变机制研究现状及生物治疗展望
椎间盘退变性疾病的发病率与复发率较高,严重影响患者的工作及日常生活。目前的治疗方法主要是缓解疼痛症状或神经受压症状,却无法阻止退变进程,这也是导致高复发的主要原因之一。目前的研究认为,椎间盘退变是一个与细胞外基质数量减少、细胞老化凋亡、炎性介质刺激和血管增生等相关的复杂程序。大量实验研究提示,椎间盘再生活性物质、干细胞移植、自体软骨细胞移植、基因治疗等方法可以不同程度地增加椎间盘细胞和基质数量,促进椎间盘再生或修复,从而逆转退变进程。日益进展的分子生物学、细胞生物学和组织工程技术为椎间盘退变的治疗提供了新的契机,而上述方法大多处于动物实验或体外实验阶段,临床应用尚存诸多挑战。本文旨在讨论椎间盘退变细胞生物学变化的研究现状,以展望未来生物治疗椎间盘退变的前景。
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椎间盘退变基因治疗进展
椎间盘退变是导致腰背痛的病理生理学原因之一。多年来,对椎间盘细胞、生化特性以及微环境的研究,发现椎间盘退变时呈现细胞凋亡、细胞数减少、重要的细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原降低和基质金属蛋白酶活性增加等。因此,20世纪90年代后期许多学者开始研究新的治疗方法,即椎间盘退变的生物学治疗。生物学治疗包括细胞治疗、基因治疗和椎间盘组织工程。当前以基因治疗具期待用于椎间盘退变的临床治疗方法。
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相关生长因子和细胞因子对延缓和逆转椎间盘变性的研究进展
椎间盘变性(disc degeneration,DD)是骨科常见病和多发病,常并发腰痛和椎间盘突出.随着年龄增长而反复发作并逐渐加重.可导致劳动能力丧失.椎间盘是一个较为复杂的生物整体,具有非常独特的解剖和生理特征,大体分为纤维环(annulus fibrosus,AF),髓核(nucleus pulposus,NP)和终板(end plates,EP).它呈现低细胞密度,包括纤维环细胞、髓核细胞以及可能存在的骨祖细胞.引起椎间盘退变的因素包括机械负荷、遗传因素和营养作用等,这些因素通过影响椎间盘细胞的活力及生物合成能力,再加上应力作用,促使了椎间盘退变的发生和发展.目前没有特别有效的治疗方法来阻止变性和渐进过程,因此寻找一种更符合生理、能够使组织再生的方法才能从根本上解决椎间盘退变的问题.近年来关于对各种调节分子包括生长因子、细胞因子等在椎间盘内的产生和相互作用,以及他们在椎间盘变性中的作用的研究日趋增多.近年新发现的骨生长蛋白-1应用于临床来促进变性的椎间盘组织恢复的可能性研究也日见报道.本文对相关的生长因子和细胞因子对延缓和逆转椎间盘变性的相关研究进行系统综述.
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细胞移植治疗椎间盘退变的研究进展
椎间盘退变是引起慢性腰痛的常见的病因之一.目前,保守疗法和手术治疗是主要治疗方法,椎间盘修复术在临床上也有应用[1].利用成人自体椎间盘细胞、软骨细胞或干细胞移植到椎间盘,即细胞移植治疗椎间盘退变的方法正处于研究的前沿.笔者就有关细胞移植治疗椎间盘退变的研究进展综述如下.
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椎间盘细胞培养过程中的反分化研究
椎间盘退变与其细胞生物学改变密切相关.本研究在观察椎间盘培养细胞传代过程中形态学变化的同时,对Ⅱ型胶原mRNA表达水平的改变进行了检测,目的在于找到一种理想的能模拟体内椎间盘退变的实验模型.
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椎间盘组织工程学研究进展
近年来体外椎间盘髓核和纤维环组织细胞培养技术的建立,特别是软骨组织工程研究的不断深入及自体椎间盘细胞移植修复髓核缺损动物实验的初步成功,为退变椎间盘的形态结构与生理功能的完全再生修复带来了希望.利用组织工程学修复退变的椎间盘是具有变革性意义的新的治疗探索.笔者就椎间盘组织工程学研究中的种子细胞、相关生长因子、细胞支架等方面的研究进展综述如下.
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腺病毒介导人胰岛素样生长因子1基因转染退变椎间盘的实验研究
退变性椎间盘病是下腰痛为常见的病因,其发生与椎间盘退变密切相关.椎间盘退变时活细胞数量减少,蛋白多糖和水的含量减低,胶原的排列和类型发生改变,Ⅱ型胶原减少而Ⅰ型胶原增多.如果能调节椎间盘细胞的生物学特性,促进退变椎间盘的细胞分裂增殖,再生蛋白多糖和胶原,恢复水分含量,就有可能阻止退变发展.本研究采用注射方法将携带人胰岛素样生长因子1(human insulin-like growth factor-1, hIGF-1)基因的重组腺病毒注入兔退变椎间盘,通过体内实验验证基因治疗对退变椎间盘的作用和疗效.
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整合素α5和肌动蛋白在周期性压力下椎间盘细胞中的表达
目的探讨整合素α5和肌动蛋白在周期性压力下椎间盘细胞中的表达.方法对猪椎间盘组织进行体外细胞的分离和培养,对细胞施加周期性液压,通过对细胞的形态学观察、Western免疫印迹和免疫组化染色,分别检测整合素α5和肌动蛋白在周期性压力下椎间盘细胞中的表达.结果经加压后,纤维环细胞和髓核细胞均可见体积缩小,由多角形转变为细长形,整合素α5和肌动蛋白在纤维环细胞和髓核细胞中的表达均明显减少.结论体外培养的单层椎间盘细胞在受力状态下,整合素α5的表达减少,整合素α5将力信号转换到细胞内时,进一步影响到与其关系密切的肌动蛋白.这可能是椎间盘细胞力学传导的重要机制.
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间充质干细胞向椎间盘细胞表型诱导分化的研究进展
间充质干细胞(MSCs)是一类存在于许多成熟骨组织中的原始细胞群,具有自我更新和增殖能力,在适宜的微环境里具有多向分化潜能.鉴于MSCs具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等优点,已作为理想的种子细胞被广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域.本文对MSCs的基础理论和实验研究进行回顾及综合分析.
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周期性牵张应力对人椎间盘纤维环细胞合成和分解的影响
目的:探讨不同牵张应力对体外培养的人椎间盘纤维环细胞合成和分解代谢的影响。方法采用Flexercell Strain Unit对人椎间盘纤维环细胞施加不同拉伸幅度的周期性牵张应力,通过Real-time PCR,蛋白印迹法,免疫组化以及阻断剂等方法,检测细胞合成代谢基因(collagen-1A1,collagen-2A1,aggrecan,versican)和分解代谢基因(MMP-3,MMP-13,ADAMTS-4,ADAMTS-5)在周期性牵张应力下椎间盘纤维环细胞中的表达。结果合成代谢基因中collagen-1A1和collagen-2A1在12%的应力条件下较对照组表达升高,collagen-2A1在18%表达下降,分解代谢基因MMP-13和ADAMTS-5在12%和18%的应变下较对照组表达升高,ADAMTS-4表达随应力拉伸幅度升高而表达增强。ERK1/2的阻断剂U0126,能明显阻断应力诱导的ADAMTS-4的表达,而p38和JNK的阻断剂SP6000125和SB203580阻断应力诱导ADAMTS-4表达作用不明显。结论不同拉伸幅度的牵张应力对椎间盘纤维化细胞的生物学行为的影响不同,其结果可以影响椎间盘的退变。
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退行性变椎间盘的细胞培养
背景:目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道.目的:采用组织块细胞培养法及酶消化细胞培养法进行成人退行性变椎间盘细胞培养的可行性.设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于1998-12/1999-04在青岛大学医学院山东省创伤骨科研究所完成.材料:5份标本来源于青岛大学附属医院骨科确诊为退行性椎间盘病变患者.方法;①组织块法培养椎间盘细胞:将组织块剪碎至小于1 mm×1 mm×1 mm,牢固敷贴于培养瓶底壁上;第1份标本加入含青霉素100 μ/mL,链霉素100 mg/L,体积分数为0.1的胎牛血清的HAMF12培养基,第18天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养.第2份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同.第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代.②酶消化法培养椎间盘细胞:将组织块剪碎加入2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化髓核30 min,离心去除上清液;消化的组织加入2 g/L的胶原酶,静止消化4 h;离心直至胶原酶完全清洗干净;取离心沉淀物置于培养瓶中;第1份标本加入足量的含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L,含体积分数为0.1胎牛血清的HAMF12培养基,第10天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养;第2,3份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同.第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代.主要观察指标:细胞的传代情况,细胞的形态学、超微结构观察.结果:①在生长及增殖过程中,体积分数为0.2胎牛血清培养细胞增殖速度明显高于体积分数为0.1胎牛血清时的速度.②髓核软骨细胞多呈星形或多角形,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,来源于纤维环的成纤维细胞呈梭形,细胞核位于梭形细胞的正中央,细胞的纤丝较长.③来源于髓核组织的细胞透射电镜下可见两类形态、结构截然不同的细胞:脊索细胞和软骨样细胞.结论:两种方法均能获得大量的退行性变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代.
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pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒构建腺相关病毒包装
背景:实验为基因治疗退变椎间盘实验的前期部分,旨在构建含免疫荧光的pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒并应用腺相关病毒包装,为后期体内外实验打下基础.目的:构建人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV- hSOX9-IRES- tdTomato的包装.方法:用酶切法将质粒pAAV-IRES- tdTomato和质粒pUC57- hSOX9连接成pAAV-hSOX9-IRES- tdTomato,用质粒共转染方法包装腺相关病毒,感染293AAV细胞,腺相关病毒纯化及用生物学滴度测定法进行滴度测定.结果与结论:经测序结果BLAST比对分析,pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato完全与合成的基因序列hSOX9相符,滴度为1×107TU/mL.结果表明,人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV-hSOX9-IRES- tdTomato包装成功.
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过氧化物酶Ⅱ对体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞的抑制作用
背景:椎间盘退变可导致髓核细胞数量的减少,过氧化物酶Ⅱ可参与细胞的抗氧化损伤、细胞分裂、分化、信号转导和凋亡等过程的调控.过氧化物酶Ⅱ对椎间盘退变有促进作用,但其机制仍不清楚.目的:观察过氧化物酶Ⅱ对体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞的活性和Ⅱ型胶原合成的影响.方法:体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞,设置对照组及过氧化物酶Ⅱ10,100和1 000 ng/L组.对照组不含氧化物酶Ⅱ,其他3组加入相应剂量的氧化物酶Ⅱ.应用免疫组化法鉴定髓核细胞,并采用cck-8试剂盒检测细胞增殖情况,于加过氧化物酶Ⅱ后第3和7天分别取对照组及各组细胞上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验测定Ⅱ型胶原表达情况.结果与结论:在体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞,随加入的过氧化物酶Ⅱ质量浓度的增加,椎间盘髓核细胞数量和Ⅱ型胶原合成逐渐减少(P<0 01).提示过氧化物酶Ⅱ对椎间盘髓核细胞的数量和Ⅱ型胶原合成有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系.以此推测过氧化物酶Ⅱ对髓核细胞的抑制作用可能是导致椎间盘退变的一种促发因素.
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人骨形态发生蛋白2促兔椎间盘细胞aggrecan和Ⅱ型胶原的合成作用
目的:研究人骨形态发生蛋白2(BMP-2)对体外培养兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原和软骨聚集蛋白多糖(aggrecan)的影响.方法:兔髓核细胞体外分离培养,分别利用Antonopulos和Miamine法检测对照组和不同剂量hBMP-2(10,100和1000 ng/ml)组胶原和蛋白多糖表达水平.RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达水平.结果:加入BMP-2后可见随剂量增加胶原和蛋白多糖表达量逐渐增加,并存在剂量依赖关系(P<0.01).在6 d RT-PCR结果显示BMP-2组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组,并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达量逐渐增加.结论:BMP-2可促进体外培养兔腰椎间盘细胞合成代谢,随剂量增加胶原和蛋白多糖表达量逐渐增加,并存在剂量依赖关系,提示hBMP-2可能对退变椎间盘具有修复功能.
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椎间盘细胞增殖和分化的研究进展
椎间盘退化是导致椎间盘病变及腰部疼痛的主要原因之一。椎间盘退化的原因包括:髓核细胞的功能降低和数量减少以及蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白等基质成分的减少[1-2];遗传因素、机体衰老以及椎间盘营养缺失、过度受压;椎间盘特殊的内环境如高渗、低氧、低营养、高酸性等[3-6]。现就椎间盘细胞增殖和分化的研究进展作一综述。
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机械刺激对体外培养椎间盘细胞的影响
椎间盘组织和细胞的生长受多种因素的影响,机械刺激是其中之一.细胞三维培养体系希望模拟体组织中细胞所处的生理环境.在椎间盘组织中细胞存在复杂应力环境,如牵张力、压应力、振动等.近年来,随着机械作用细胞培养模型的建立,应力对体外培养椎间盘细胞作用的研究得以实现.
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椎间盘退变的分子治疗研究进展
椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞和细胞外基质成分的变化,如髓核细胞由软骨细胞表型转变为纤维软骨细胞表型,细胞外基质中蛋白多糖、水及Ⅱ型胶原蛋白丢失破坏了正常椎间盘和椎体的解剖结构,直接导致椎间盘力学特征丧失.
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机械刺激信号对椎间盘细胞影响的研究进展
机械刺激对维持椎间盘及其基质的正常代谢具有重要作用,主要通过直接或间接刺激椎间盘细胞影响椎间盘细胞的增殖、分化、凋亡、生物基质的分泌等,从而维持整个椎间盘的代谢平衡. 近年来,机械刺激,尤其是轴向负荷及流体力刺激如何改变椎间盘细胞生物化学功能的问题,逐渐成为研究热点. 该文对轴向负荷和流体力等机械信号刺激椎间盘细胞的应答机制、以及机械刺激对椎间盘退化的影响和椎间盘退化的生物学治疗方法进行综述.
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Fas配体对椎间盘细胞经典凋亡通路中关键因子的影响
目的明确Fas配体(FasL)介导的大鼠椎间盘细胞的确切凋亡途径。方法分离、培养大鼠腰椎间盘髓核细胞,分别与含不同浓度FasL (0、5、10、20、50 ng/ml)的1%胎牛血清(FBS)培养基共培养24 h,分别检测Fas,Caspase-8、9、3及Bid mRNA的表达水平,Caspase-8、9、3的酶活性以及线粒体膜电势的变化。结果髓核细胞与不同浓度FasL共培养24 h后,经Hoechst 33258染色均可观察到细胞凋亡, Caspase-8、3及Bid mRNA的表达水平,Caspase-8、3的酶活性均随FasL浓度的升高而升高;50 ng/ml的FasL可明显增强Caspase-9 mRNA的表达、Caspase-9的酶活性和线粒体膜电势。结论FasL所诱发的椎间盘细胞凋亡主要通过膜途径进行,大剂量时可以激活线粒体途径。