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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定
目的：：建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs 进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法：用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果：72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上；取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达；细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论：全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs 具有多项分化潜能。
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一种用于HCV核心蛋白体外表达研究的CHO细胞模型的建立
目的:建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白体外表达的非肝细胞模型.方法:核酸酶切法鉴定含有HCV1b基因型C蛋白编码基因的重组质粒pCMH6K的稳定性,将pCMH6K瞬时及稳定转染于中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞并连续传代110 d,免疫荧光法检测转染细胞内HCV C蛋白分布特征,RT-PCR法检测转染细胞内HCVC mRNA.结果:pCMH6K含有与HCV1b基因型C蛋白编码基因(573 bp)相一致的特异性片段；在pCMH6K瞬时以及稳定转染的CHO细胞内可见HCV C蛋白主要分布在胞质,少部分在胞膜;在不同时期稳定转染CHO细胞中均可见到与HCV C mRNA相一致的基因特异性片段(267 bp).结论:成功建立了能够持续表达HCV C蛋白的CHO细胞株.
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椎间盘细胞培养过程中的反分化研究
椎间盘退变与其细胞生物学改变密切相关.本研究在观察椎间盘培养细胞传代过程中形态学变化的同时,对Ⅱ型胶原mRNA表达水平的改变进行了检测,目的在于找到一种理想的能模拟体内椎间盘退变的实验模型.
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浅谈表皮干细胞传代于脱细胞真皮基质所形成的复合皮的体会
20世纪70年代发明了自体表皮干细胞培养技术,逐渐应用于临床,但是南于自体表皮细胞缺乏真皮结构,收缩性大,不易转移和固定,移植后很脆弱,抗感染能力差,导致其移植成功率很不稳定,成活以后易产生严重的瘢痕,因此单纯的角质细胞培养和移植临床很少应用.将表皮干细胞传代于脱细胞真皮基质形成的复合皮移植效果较单纯的角质细胞明显提高,为烧伤患者的皮肤再生提供新的方法.
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戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖
目的探索戊型肝炎病毒(HEV)敏感细胞及体外培养条件,为HEV体外研究提供基础.方法用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化,超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞(包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞(非洲绿猴肾细胞Vero),通过细胞病变观察、RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感.结果 KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7～9 d出现细胞病变,11～13 d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela、Vero细胞未见细胞病变,分别于2-4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段.在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段.结论在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感,本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系.
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人表皮干细胞的培养技术
近年来,人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点,表皮干细胞即是其中之一.表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群,在正常状态下维持表皮的自我更新,当受到损伤刺激时,表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1].
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人肝癌细胞HepG2培养方法探究与分析
① 目的 探究人肝癌细胞HepG2合适的培养方法 .② 方法对比复苏中先40℃ 水浴溶解后37℃ 温浴与37℃ 水浴溶解细胞的存活率,确定佳复苏方法;对比采用一步消化法和分步消化法的细胞状态以选择适传代消化方法;对比手动慢速冻存法 、程序降温盒慢速冻存法与玻璃化冻存法冻存效果以选择合适冻存方法;对比刚复苏细胞用10％ 、12％ 、15％ 血清浓度DMEM培养液培养,确定其所需血清适浓度.③ 结果 复苏采用先40℃ 水浴溶解后37℃ 温浴,细胞平均存活率(81.0％)显然比37℃ 水浴溶解(69.3％)高;分步消化法效果比一步消化法效果好;冻存采用程序降温盒效果佳,玻璃冻存法次之,手动慢速冻存效果差;采用10％ 血清浓度的DMEM培养液培养刚复苏细胞增殖慢,死细胞多,12％ 血清浓度的死细胞少,但是增殖慢,而15％ 血清浓度的死细胞少且细胞增殖快.④ 结论 HepG2细胞复苏采用先40℃ 水浴溶解后37℃ 温浴,消化传代用分步消化法,冻存用程序降温盒,-80℃冰箱过夜,随后液氮中保存;刚复苏的细胞采用血清含量为15％ 的DMEM培养液效果好.
关键词： 人肝癌细胞HepG2 复苏 细胞传代 冻存 血清浓度 -
干细胞与周围神经损伤修复
目前周围神经缺损的修复仍是临床的一大难题.周围神经系统具有再生的潜能,但在自体神经移植中受到取材长度的限制,近年来许多学者将体外培养扩增的大量雪旺细胞种植到神经导管中,以引导周围神经再生,然而在适当条件下难以维持大量的雪旺细胞,雪旺细胞传代后形态和功能逐渐改变.体外培养的干细胞,尤其是中枢来源的干细胞,具有低免疫原性,可以分化为雪旺细胞,移植至受损部位后可促进神经再生.本文综述了干细胞在修复周围神经损伤中的应用及其在再生过程中所发挥的作用.
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骨髓基质干细胞体外诱导分化为施旺细胞的研究进展
骨髓基质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,除了分化为间充质细胞谱系外,还具有向非间充质细胞谱系如神经细胞分化的潜能,在体外适宜的条件下可以诱导分化为施旺细胞.多种抗氧化剂可以诱导骨髓基质干细胞分化为施旺细胞,分化所需时间较短;多种生长因子亦有同样的作用,诱导的施旺细胞传代时寿命延长;抗氧化剂和生长因子合用,分化施旺细胞的数量更多,传代时寿命更长.
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细胞传代对骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的影响
背景：体外持续细胞传代是否影响骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞的机制尚未明确。
目的：观察细胞传代对骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的影响。
方法：采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞，取传代至第3，6，9，12代的骨髓间充质干细胞，在无血清神经干细胞培养基中诱导培养7，14 d，观察细胞生物学特征，通过流式细胞仪检测Nestin的表达情况观察骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化能力，再进一步诱导分化，通过免疫组织化学荧光技术检测神经烯醇化酶及胶质酸性蛋白表达，以鉴定神经干细胞的多向分化能力。
结果与结论：各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均分化成神经干细胞，Nestin表达阳性，各组细胞分化的比例差异有显著性意义(P<0.05)，其中第6代骨髓间充质干细胞分化能力强，诱导7 d及14 d Nestin阳性细胞的比例分别为(93.7±2.3)%，(96.2±1.8)%，第6，9代明显较第3，12代骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的比例高，且所得神经干细胞球经贴壁分化后可表达神经烯醇化酶、胶质酸性蛋白。结果表明，骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化与细胞传代有关，过早或过晚均不利于分化。 -
β-TCP三维支架用于骨髓间充质干细胞原位冻存研究
目的:探索骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)三维扩增原位冻存策略实践性及其对传代迁徙和成骨分化能力的影响.方法:制备β-TCP三维支架,相对2D平板考察三维扩增细胞数,冻存后以CCK-8染色计数考察收获冻存效率,迁徙率,并以ALP染色考察总体成骨分化水平和比分化活力.结果:与2D平板相比,3D培养速率提升7倍,原位冻存细胞收获存活效率由传统消化吹打方式的55.9%提升为81.3%;冻存处理后其迁徙率传代效率下降无统计学意义(P>0.05),比ALP活性经冻存处理非但未下降,反而在迁徙传代支架上显著性提升.结论:利用β-TCP三维支架扩增、传代MSC并进行原位冻存不影响传代迁徙能力,对成骨分化水平反而有贡献作用,具有较好的科研及工业生产应用前景.
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中药灵芝与黄精抗衰老作用的实验研究
众所周知,中药在抗衰老和防病方面有广阔的前景.我们选用全国著名老中医张镜人教授抗衰老经验方"益神冲剂"中主要药物灵芝、黄精进行细胞传代实验研究,旨在探讨其益气扶正、抗衰老的作用机理.
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网孔过滤法分离纯化肌源性干细胞
探讨乳大鼠肌源性干细胞的体外培养及纯化分离方法.采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化乳大鼠骨骼肌,网孔过滤纯化肌源性干细胞后,通过体外原代和传代培养,经生长曲线、细胞融合率等指标研究肌源性干细胞的增殖和分化能力,免疫细胞化学染色法进行鉴定.结果表明:通过上述方法分离得到小圆形或短梭形的细胞,免疫细胞化学染色desmin及CD34为阳性.说明网孔过滤法可提高肌源性干细胞的纯度.
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脂联素对老化骨髓间充质干细胞自发性骨化的影响
目的 探讨老化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的自发性骨化过程及脂联素在这一过程中的作用.方法 将第2代BMSCs(分离自一小儿畸形断肢的残指)分为空白对照组及脂联素低、中、高剂量组.空白对照组加入DMEM/F12培养基及10%胎牛血清,脂联素低、中、高剂量组分别在此基础上加入终浓度为0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂联素,各组均传代培养至第10代.收集各组第2代和第10代细胞,茜素红S染色后计算钙化物染色率,qPCR法检测骨钙素(OCN)mRNA相对表达量.结果 与第2代细胞比较,各组第10代细胞钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均升高(P均<0.05);与空白对照组第10代细胞比较,脂联素低、中、高剂量组钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均升高,但脂联素中、高剂量组升高更明显(P均<0.05).结论 BMSCs在传代过程中可发生自发性骨化,脂联素可促进这一过程,并呈浓度依赖性.
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bmi-1基因与肿瘤靶向治疗
目前肿瘤的治疗基于杀死增殖细胞,能有效地减少肿瘤的量,但却易复发.普遍认为在许多肿瘤中存在着对传统放、化疗更具抵抗性的亚群细胞,这种独特的细胞群能导致肿瘤的复发和转移,并促发新的肿瘤;且越来越多的证据表明克隆性肿瘤干细胞的存在[1-2].而目前市场上尚无针对这类细胞的抗肿瘤药物,因此,开发这类药物用于肿瘤防治具有很好的应用前景.B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位点1(B-cell-specific Moloney murine leukemiavirus integrationsite 1,bmi-1)是多梳基因家族(polycomb groupgenes)的一种转录抑制因子,首次被提出是在转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中[3],目前是一种公认的原癌基因.研究证实,bmi-1基因通过多种途径参与正常及肿瘤细胞的更新、增殖和永生化,因此,bmi-1基因逐渐成为一种潜在的肿瘤治疗靶点.现就bmi-1基因在肿瘤靶向治疗中的作用作一综述.
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软骨细胞的永生化及其生物学特性
软骨由软骨细胞、胞外基质（胶原纤维、蛋白多糖）及水组成。其中后两者所占比例较大，软骨细胞数量较少，所以从软骨中获得软骨细胞来源有限［1］；并且软骨细胞增殖能力低，代谢缓慢，体外培养对密度高度依赖，且为有限增殖，传代到第9代左右，细胞出现老化现象，使传代难以为继。特别是软骨细胞在体外长期培养有去分化的趋势，表型（特别是Ⅱ型胶原）难以保持［2］。上述这些问题，都是软骨细胞库建立及软骨细胞工程必须解决的难题。因此,众多学者一直试图建立一种能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。 一、 永生化的定义及意义 所谓“永生化”（immortalization），就是指细胞处于连续的细胞周期而终止其发育进程，通俗一点说就是“使细胞获得了无限的增殖能力”［3］。建立永生化细胞至少具有以下几点优势：①可以在体外研究软骨细胞的分化与生长及增殖之间的关系。②永生化的软骨细胞可以考虑作为软骨细胞工程的细胞库或基因治疗的靶细胞，前者为软骨组织工程提供大量的经过预先处理和优化的软骨细胞，真正做到“组织工程化”；后者则使基因治疗应用于软骨细胞成为可能，因为正常软骨细胞传代、增殖有限的缺点妨碍了基因转染阳性靶细胞的挑选、鉴定及回输。③可以作为药理或毒理研究的标准细胞。④有利于对各项实验结果进行比较，因为各个实验室的软骨细胞来源不同，培养方法各异，传代千差万别，使得实验结果难以比较。
