mTOR通路通过 CD44促进神经元再生机制的研究

目的：：神经损伤类疾病的治疗一直是困扰医学界的难题,主要由于神经元损伤后难以再生,因此,阐明神经元内再生的机制是治疗神经损伤类疾病的关键。研究表明mTOR信号通路是提高神经元内在再生能力的重要因素,激活mTOR可有效促进神经纤维的再生,但其作用机制尚不清楚,我们利用生物信息技术检索到mTOR通路与神经再生相关的蛋白质阵列,发现细胞粘附分子CD44与轴突再生密切相关。本研究观察mTOR通路激活后,相关CD44分子表达是否上调及其与神经元突起生长的内部联系,探讨mTOR通路是否通过CD44分子促进神经元突起生长,进而提高神经元的再生能力。方法：(1)体外培养SH-SY5Y细胞,10μMol/L全反式维甲酸诱导SH-SY5 Y细胞分化,使其具有成熟神经元的特征。(2) RNAi技术对诱导分化的SH-SY5 Y细胞PTEN基因干扰。结果：24 h后RT-PCR结果显示PTEN基因的转录水平与对照组相比明显下调。36 h后Western blot结果显示干扰组细胞的mTOR与Ps6 K蛋白的表达水平与阴性对照组和空白对照组相比明显上调,说明PTEN 抑制激活了mTOR通路。干扰PTEN基因24h之后,RT-PCR结果发现实验组CD44转录水平上调,与阴性对照组和单纯诱导组相比差异显著。(3) image proplus 6.0分别对各实验组细胞进行轴突长度测量,并将各组数据分别进行统计学分析结果表明PTEN干扰组细胞的突起长度明显长于单纯诱导组和阴性对照组。 PTEN RNAi与CD44 RNAi共同干扰后,PTEN单纯干扰组细胞轴突长度明显长于共同干扰组和单纯诱导组细胞的轴突长度,差异显著。结论：mTOR通路激活后通过CD44分子表达上调促进神经细胞轴突生长。

嗅神经鞘细胞对胚胎大鼠脊髓后解神经元突起生长的促进作用

实验证实,嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)可促进多种神经元轴突的生长,如背根节神经元、视网膜节细胞以及向脊髓投射的皮层神经元、前庭神经元、中缝核神经元,等等.近年OECs移植用于脊髓损伤后再生研究,已成功促进下行传导路纤维的再生和运动功能的恢复[1].但目前就OECs对脊髓后角神经元的作用目前还缺乏研究.本实验的目的就是观察原代培样的OECs对胚胎脊髓后角神经元的突起生长有无促进作用,从而为进一步的体内移植实验提供依据.

阿托伐他汀通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导而促进神经元突起生长

目的 探讨阿托伐他汀(Ato)对体外培养大鼠皮质神经元突起生长促进作用的信号转导机制.方法 取培养7 d大脑皮质神经元,分为Ato 10 μmol·L-1作用48 h组和阻断剂+Ato组,先分别加入阻断剂PD98059 50 μmol·L-1、LY294002 30 μmol·L-1、曲西立滨(TCBN)2.5 μmol·L-1和西罗莫司(雷帕霉素,Rapa) 100 nmol·L-1作用1 h,再加入Ato共同作用48 h.应用倒置相差显微镜观察神经元突起生长状况;Western 印迹法检测磷酸化的磷酸肌醇依赖激酶1(PDK1)、磷酸化蛋白激酶B(Akt)、磷酸化西罗莫司靶蛋白(mTOR)、磷酸化的核糖体S6激酶(p70S6K)和磷酸化的真核翻译起始因子4E结合蛋白 1(p-4E-BP1)的表达.结果 形态学观察结果显示,Ato 10 μmol·L-1组可明显促进突起生长,表现为突起总长度增加、一级突起数目增多、末端分支数增多及胞体面积增大.PD98059,LY294002,TCBN和Rapa均可阻断Ato对神经元突起生长的促进作用.Western印迹结果显示,Ato 10 μmol·L-1可显著上调p-PDK1,p-Akt(Ser473),p-mTOR,p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平(P<0.01).LY294002可显著阻断Ato引起的p-PDK1,p-Akt(Ser473) 蛋白表达水平增加(P<0.01).TCBN 可显著阻断Ato引起的p-mTOR蛋白表达水平增加(P<0.01).Rapa可明显阻断Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平增加(P<0.01).结论 Ato对体外培养皮质神经元突起发育的促进作用可能与激动MEK/ERK信号转导通路有一定的关系,主要可能与通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关.

突变型α-突触核蛋白对大鼠原代培养神经元突起生长作用研究

目的 观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其突变体A30P和A53T对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,揭示突变体A30P和A53T在帕金森病的发病机制中的作用.方法 取大鼠大脑皮质神经元分组培养,在细胞外添加A30P、A53T和α-Syn,培养1h、2h和4h后固定,比较A30P、A53T与α-Syn对神经元突起生长的影响.神经元突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性.结果 添加α-Syn组的神经元培养至1、2和4h时,其突起的平均长度大于对照组和添加A30P、A53T组(P＜0.05).A30P、A53T组和对照组的神经元突起长度差异无统计学意义(P＞0.05).增加蛋白的含量,浓度越高,α-Syn组神经元突起的平均长度与添加A30P和A53T组差异越大(P＜0.01).Western blotting和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn可以从培养基进入到神经元内,并均匀分布在胞体和突起.而A30P和A53T组,并未发现.结论 α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,突变体A30P和A53T,无促神经元突起生长作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关.

α-突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长

目的 观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其形成的寡聚体对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,探讨其寡聚化对神经元的毒性及其在帕金森病发病机制中的作用.方法 制备α-Syn的寡聚体,向分组培养的大鼠脑皮质神经元培养基中添加,培养1、2和4h后固定,观察对神经元突起生长的影响.神经元的突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法实验进行鉴定.结果 添加α-Syn寡聚体组的神经元培养至1、2和4h时,其突起的平均长度均小于对照组和添加α-Syn单体组(P＜0.05).增加α-Syn寡聚体浓度,随浓度增高神经元突起的平均长度与对照组差异越大(P＜0.01).Western blotting法和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn寡聚体可以从培养基进入到神经元内.结论 α-Syn寡聚体在原代神经元生长初期对其突起生长具有抑制作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关.

Neuritin的研究进展

neuritin是神经营养因子的一个新成员,它可以被神经活动和神经营养素诱导,其表达产物能够维持神经元的存活和突起生长,在神经再生和治疗神经系统退行性病变的应用前景广泛.我们对其基因结构、表达、功能以及调节等方面进行综述.

Dok6促进神经营养因子3诱导的过表达原肌球蛋白相关激酶C的PC12细胞突起生长

目的 探讨胞浆接头蛋白Dok6对PC12细胞突起生长的影响.方法 将Dok6的不同功能模体片段构建至TrkC/Y516F突变体中形成融合克隆.利用Western blot法验证各个融合克隆在细胞内是否稳定表达.利用瞬时转染的方法将融合克隆导入PC12细胞进行过表达,之后用NT-3刺激PC12细胞突起生长,检测不同Dok6片段的效应.结果 各个融合克隆均能在细胞内稳定表达.融合了Dok6 PTB结构域+C末端以及单纯C末端的融合克隆均可以挽救由于TrkC受体516位酪氨酸突变导致的PC12细胞突起生长减少,而融合单纯的Dok6 PTB结构域则无此效应.结论 Dok6可以促进NT-3诱导的过表达TrkC的PC12细胞突起生长,并且此效应与其C末端密切相关.

MRI评价NGF对缺血性脑损伤治疗作用的研究进展

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经系统主要的神经营养因子之一,也是早被发现、目前唯一被阐明其结构的一种神经细胞生长调节因子,兼有神经元营养和促突起生长双重作用[1].

双胸蚓溶栓酶对体外培养的WISTAR胎鼠大脑神经元突起生长的影响

突变型α突触核蛋白对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响

目的 观察α-突触核蛋白(α-Syn)和其家族性突变型A30P和A53T对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响.方法 取大鼠前脑皮质神经元进行分组培养.在培养基中添加α-Syn和其突变体A30P、A53T,培养至1 h、2h和4h进行观察,比较A30P、A53T与α-Syn对原代培养神经元生长的影响.神经元以成像显微镜观察并计数,Western印迹法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性.结果 添加α-Syn组的神经元培养至1 h、2h和4h时,其神经元的平均存活率大于对照组和添加A30P、A53T组(P＜0.05).A30P组和A53T组的神经元存平均活率与对照组无差异(P＞0.05).增加蛋白的浓度,α-Syn组神经元存活率与添加A30P和A53T组差异越大(P＜0.01).western blot和免疫荧光实验证实α-Syn可由培养基进入到神经元内,而A30P和A53T不能进入神经元.结论 α-Syn在大鼠皮质原代神经元培养初期对其存活率具有促进作用,而其突变体A30P和A53T无这一作用,这一现象与其发生家族性突变有关,并可能成为导致PD发病原因之一.

银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元活性和生长的影响

目的 探讨高胆固醇和载脂蛋白E4(apoE4)对海马神经元生长和活性的影响及银杏内酯B的保护作用.方法 采用无血清培养基体外培养初生大鼠海马神经元,采用神经元特异性烯醇化酶免疫荧光进行鉴定.用160 μg/ml的银杏内酯B处理海马神经元16 h,40 μg/ml 25-OH-胆固醇和30μg/ml apoE4继续处理24 h.MTT比色实验观察海马神经元生长活力的改变;Image-Proplus分析系统观察神经元长突起长度和胞体长短经的改变.结果 25-OH-胆固醇和apoE4降低海马神经元活性,抑制海马神经元突起的生长,与单纯apoE4和单纯胆固醇相比有显著性差异;银杏内酯B对神经元活性有提高趋势,但与模型组无显著差异(P＞0.05),银杏内酯B可以有效促进损伤神经元突起生长,与模型组相比有显著差异(P＜0.05).结论 高胆固醇在apoE4环境下损伤海马神经元,促进老年性痴呆的发生,银杏内酯B对损伤神经元在一定程度上有保护作用.

α-突触核蛋白功能片段对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用

目的:研究人α-突触核蛋白(α-Syn)对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用,阐明该蛋白质的功能片段,并探讨其作用机制.方法:获取新生Wistar大鼠大脑皮层神经元分组培养,分别加入α-Syn(添加α-Syn组)、α-Syn功能片段N端(添加N端组)、C端(添加C端组)和NAC段(添加NAC段组),对照组不添加功能片段.倒置相差显微镜观察各组神经元突起的长度,Western blotting法、免疫荧光法特异性鉴定各组α-Syn蛋白的表达水平.结果:在生长至1和2h,添加C端组和α-Syn组的神经元突起平均长度长于对照组(P＜0.05),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；生长至4h,添加α-Syn 组和C端组的神经元突起平均长度明显长于对照组(P＜0.01),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).Western blotting和免疫荧光法检测,N端和C端可以进入神经元,NAC段不能进入神经元.结论:α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,具有这一功能的片段位于C端,其机制可能是其通过胞膜进入到神经元内,促进微管蛋白聚合形成微管,加速细胞骨架的形成和轴浆转运.

人参总皂苷对PC12细胞突起生长及GAP-43表达的影响

目的 探讨人参总皂苷(Total saponin of panax ginseng,TSPG)对神经细胞PC12突起生长以及生长相关蛋白-43(Growth-associated protein-43,GAP-43)表达的影响.方法 以0、10、20、40、80 mg/L TSPG作用于体外培养的PC12细胞,相差显微镜观察细胞的形态学改变,透射电镜观察细胞突触连接情况,显微镜测微尺测量突起长度,免疫组织化学和Western blot法检测GAP43的表达.结果 与对照组相比,TSPG处理组分化的PC12细胞直径明显增大,突起长度明显增长,并形成突触连接,GAP-43表达水平增加,以40 mg/L组为明显.结论 TSPG可诱导PC12细胞发生分化、突起生长延伸,并可上调GAP-43的表达水平.

大黄素甲醚对体外新生大鼠皮质神经元的营养作用

目的 研究大黄素甲醚对新生大鼠皮质神经元的神经营养作用.方法 体外以0.4％ B27+ DMEM/F12培养出生24h内的大鼠皮层神经元.采用NSE免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定.分为溶媒对照组,大黄素甲醚(0.5、1、2、4μmol/L)组和碱性成纤维细胞生长因子bFGF( 10 ng/mL)组.显微镜观察各组皮质神经元的形态,利用软件统计神经元平均突起长度;MTT法检测神经元的存活情况;RT-PCR检测MAP-2表达量.加入Trk受体抑制剂或腺苷受体抑制剂单独作用或与大黄素甲醚相互作用,检测突起长度变化.结果 与溶媒对照组相比,培养3d后的大黄素甲醚1、2、4μmol/L剂量组均可延长神经元的存活时间,促进神经元突起生长,增加MAP-2 mRNA的表达量.加入Trk受体抑制剂能抑制大黄素甲醚对神经元的影响,而加入腺苷受体抑制剂则无影响.结论 大黄素甲醚对新生大鼠皮层神经元具有神经营养作用.

血清与全反式维甲酸对神经干细胞分化及突起生长的作用差异

目的:比较血清与全反式维甲酸(RA)2种诱导条件对神经干细胞分化及神经元突起生长作用的差异.方法:取E12.5 d的胚胎小鼠皮层分离培养得到神经干细胞,然后分别用低浓度2％ 的血清和1μmol/L RA诱导神经干细胞分化3 d和7 d,用免疫荧光鉴定神经干细胞分化特征.结果:RA诱导组中的神经元比例显著高于血清诱导组,长期诱导至7 d其仍保持较高的水平,但其星形胶质细胞比例明显低于血清诱导组;随着诱导时间的延长,RA诱导组中神经元突起的长度和数目也都显著长于和高于血清诱导组;另外,血清和RA诱导形成的胶质细胞的形态特征不一致.结论:RA相较于血清更利于诱导神经元的分化以及突起的生长,而血清更利于诱导星形胶质细胞的分化.

脑源性神经营养因子与中枢神经修复再生

神经营养因子在保护神经元存活并促进其突起生长发育过程中,常出现基因表达的时相变异,对不同种类的神经元有明显的作用选择性.脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员,广泛分布于大脑中,是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡,改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用.本文就其理化性质、生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用等进行综述.

神经生长因子促神经再生的研究进展

神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是早被发现、兼有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种细胞调节因子.它对中枢和周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用,可促进受损神经再生、免受继发性损害、减少细胞死亡、支持神经元存活.本文就NGF的作用机理,对神经系统的生物效应,对神经再生的影响及外源性神经生长因子的应用途径等相关研究进展作一综述.

CREST对N2a细胞突起生长的影响

目的：观察钙反应性反式激活因子（ CREST ）过表达对小鼠神经母细胞瘤（ N2 a ）细胞突起生长的影响。方法实验分为3组，实验组用pCMV-HA-CREST转染的N2 a细胞，空载体对照组用pCMV-HA转染的N2a细胞，空白对照组用未转染任何试剂的N2a细胞，分别加入70mmol/L KCl 孵育过夜。在转染后24h，48h采用考马斯亮蓝染色法检测N2a细胞突起生长状态。结果在转染后24h，CREST基因过表达的细胞与两对照组细胞相比较，细胞突起生长差异无显著性。在转染后48h，CREST基因过表达的细胞与两对照组细胞相比较，突起生长明显，部分突起交织成网络。两对照组间在细胞转染后各时间点突起生长状态差异无显著性（ P＜0．05）。结论过表达CREST可促进N2 a细胞突起的生长。

PACAP促PC12细胞突起生长的分子机制

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)具有广泛的生理功能.近年来的研究发现,PACAP具有重要的神经营养作用.PACAP可通过激活多条细胞内信号转导通路,促使PC12细胞突起生长,使其向神经元样细胞分化.本文综述了PACAP引起PC12细胞突起生长的信号转导通路,有助于深入了解PACAP神经营养作用的分子机制.

阿魏酸对bFGF诱导PC12细胞分化的影响

目的:探讨阿魏酸在低浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞(PC12细胞)分化的作用及其初步机制.方法:在0 ng/mL或1 ng/mL bFGF条件下培养PC12细胞,以PC12细胞的突起长度及诱导率确定药效.结果:阿魏酸在无bFGF的情况下不能诱导PC12分化,但在低浓度bFGF(1 ns/mL)情况下,与bFGF(1 ns/mL)对照组比较可明显诱导PCI2细胞分化(P<0.01),这种作用能被有丝分裂原激活的蛋白激酶,(MAPK)特异性抑制剂PD98059所抑制.结论:阿魏酸可增强bFGF诱导PCI2细胞分化,其机制可能与MAPK信号通路有关.