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溶酶体在帕金森病中的作用研究进展
帕金森病((Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其发病机制仍不明确,病理学基础主要表现为黑质致密部多巴胺神经元的丢失以及Lewy小体的聚集.溶酶体以一种可控的方式对细胞成分的降解发挥着重要作用.越来越多的证据表明溶酶体功能的损伤在PD的发病中至关重要.本文将对溶酶体在PD中的作用进行总结,并且针对溶酶体功能的损伤提出相关的治疗策略.
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细胞自噬与神经退行性疾病的研究进展
细胞自噬广泛存在于真核细胞中,是细胞内的一种“自食”的现象,膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体,并与内涵体形成自噬内涵体,在激素和溶酶体的介导下降解体内多余的蛋白质和细胞器,维持体内外内环境和神经元的稳态,对机体起到保护的作用.神经退行性疾病是一类以蛋白质异常蓄积为特点的中枢神经系统退行性疾病.近年来的研究表明,通过自噬可以有效的清除神经系统中异常积聚的蛋白质和细胞器,利用提高细胞自噬能力对神经退行性疾病进行治疗具有光明的前景,从而减轻其临床症状.
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安颤灵对帕金森病模型旋转行为及UPS功能影响的研究
目的 探讨中药安颤灵对帕金森病(PD)大鼠模犁泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能的影响.方法 采用lactacystin立体定向注射人大鼠左侧黑质致密部和黑质纹状体通路,建立PD大鼠模型.经行为测试造模成功的PD模型大鼠27只,随机分为模删组与中药组,每组10只,同时另取10只脑内注射牛理盐水未出现旋转行为的大鼠作为正常对照组.正常对照组和模型组用牛理盐水灌胃,中药组同时间等体积安颤灵灌胃,共5 W.给药后第1、3、5周分别行阿朴吗啡(APO)诱导,观察记录其旋转行为及其他异常行为.给药结束后每组随机取6只大鼠行免疫组织化学检测,观察各组α-突触核蛋白(α-synuclein)、泛素(ubiquitin)蛋白表达.结果 中药组对APO诱导的旋转行为有明显抑制作用,与模型组相比较,其旋转圈数明显减少(P<0.01).与模型组相比,中药组α-synu-clein与硫磺素S、ubiquitin与硫磺素S荧光舣标染色阳性均较弱.结论 安颤灵可改善PD大鼠旋转行为及UPS的功能.
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姜黄素对帕金森病小鼠运动障碍和多巴胺能神经元存活的影响及机制研究
目的 观察姜黄素对帕金森病小鼠运动障碍的影响以及对多巴胺能(DA)神经元的保护作用并探讨其作用机制.方法 50只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组、模型组、姜黄素组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和姜黄素+3-MA组,每组10只.模型组采用1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射建立帕金森病模型,姜黄素组、3-MA组、姜黄素+3-MA组在MPTP腹腔注射的同时分别予姜黄素、3-MA以及姜黄素联合3-MA腹腔注射,正常对照组腹腔注射无菌生理盐水.各组小鼠在后一次药物注射后1、7、14d进行爬杆、悬挂、旷场实验等行为学测试,14d时处死取中脑黑质脑组织行酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色观察DA神经元存活数目,Western blot检测α-突触核蛋白(α-Syn)和自噬特异蛋白LC3-Ⅱ的表达.结果 与正常对照组比较,1、7、14d时模型组小鼠爬杆时间均延长(P＜0.01),悬挂实验分值均降低(P＜0.01),旷场实验总距离及平均速度均减少(P＜0.01),小鼠黑质DA神经元存活数目减少(P＜0.01),α-Syn和LC3-Ⅱ蛋白表达均增加(P＜0.01).与模型组比较,7、14 d时姜黄素组爬杆时间缩短(P ＜0.05,P＜0.01),悬挂实验分值、旷场实验总距离及平均速度均增加(P ＜0.05,P＜0.01),黑质DA神经元存活数目增加(P＜0.01),α-Syn蛋白表达下调(P＜0.01),LC3-Ⅱ蛋白表达增加(P＜0.01).与模型组比较,14d时3-MA组小鼠爬杆时间延长(P＜0.01),旷场实验总距离及平均速度均减少(P＜0.05),黑质DA神经元存活数目减少(P＜0.05),α-Syn蛋白表达增加(P＜0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达下调(P＜0.05).姜黄素+3-MA组上述结果与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 姜黄素可改善帕金森病小鼠的运动障碍,保护DA神经元,通过增加细胞自噬功能从而促进α-Syn的自噬性清除可能是其主要作用机制.
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猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析
目的：对猫突触核蛋白（α?synuclein ）进行克隆、表达及纯化，并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α?synuclein基因的保守区域内设计引物，从猫脑cDNA文库中PCR扩增得到猫的α?synuclein基因，再将此基因双酶切后克隆到pET28a原核表达载体中，构建重组质粒，测序正确的重组质粒转化BL21（ DE3）大肠杆菌，采用IPTG诱导表达。然后对猫α?synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑cDNA文库中扩增出α?synuclein基因，基因全长381个碱基，编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入pET28a，后转染大肠杆菌BL21（ DE3），获得可溶性表达的α?synuclein蛋白质，蛋白质分子量为13?12kD，与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α?synuclein蛋白与人源及鼠源α?synuclein氨基酸具有很高的同源性，分别为87?35％和83?15％，但是与鼠和人的氨基酸序列比较，猫α?synuclein氨基酸缺失41～54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α?synuclein具有很好的疏水性，有助于诱导表达时形成可溶性蛋白，这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α?synuclein基因，并在大肠杆菌中实施了可溶性表达，为后期研究α?synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。
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α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体Ⅰ活性
目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性的影响.方法 用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α-SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运;通过观察340 nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性.结果 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后,以剂量依赖的方式转运到线粒体内.将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后,线粒体复合体Ⅰ活性下降,并且呈明显的量-效关系.结论 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.线粒体的α-SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运,并调节复合体Ⅰ的活性.
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过表达GBA诱导SH-SY5Y细胞自噬和降低α-synuclein的表达
目的 探讨葡萄糖脑苷脂酶(GBA)对SH-SY5Y细胞自噬及α-突触核蛋白(α-synuclein)表达水平的影响.方法 将EGFP-N1、EGFP-GBA质粒转染SH-SY5Y细胞,Western blot检测Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及α-synuclein蛋白的表达,荧光显微镜观察自噬泡的形成及LC3与GBA在细胞内的共定位.结果 与转染EGFP-N1组相比,转染EGFP-GBA组上调Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达水平(P＜0.05),而α-synuclein表达水平则下降(P＜0.05);与转染EGFP-N1组相比,转染EGFP-GBA组自噬空泡数目明显增加,外源性LC3免疫荧光表达明显增强,且GBA与LC3存在共定位.结论 GBA上调自噬水平,降低α-synuclein蛋白的表达.
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α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用
目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用.方法 应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN(WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN(S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响.结果 实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达(P<0.01).WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降(P<0.01),共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高(P<0.01).结论 129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性.
关键词： α-突触核蛋白 磷酸化α-突触核蛋白 神经元保护 多巴胺神经元 -
APP/PS1双转基因AD小鼠术后认知功能紊乱及其机制
目的 探究阿尔茨默海病(AD)双转基因小鼠(APP/PS1)在麻醉手术后不同时程的认知功能改变及其可能的机制.方法 将APP/PS1小鼠随机分为对照组(不予手术麻醉干预)和实验组(2.5％七氟烷麻醉下行剖腹探查术).术后1和3 d行条件恐惧实验评估小鼠认知功能;并分别在术后12及24 h和3 d用酶联免疫吸附实验检测海马组织炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α及淀粉样蛋白Aβ42蛋白含量;用Western blot检测 α-突触核蛋白的表达.结果 与对照组相比,实验组小鼠在术后1和3 d,与场景有关的僵直时间均显著减少.术后24 h实验组小鼠海马组织内IL-1β、IL-6及TNF-α的含量显著高于对照组(P<0.05);同时Aβ42蛋白和α-突触核蛋白的表达在术后24 h也显著上调(P<0.05).结论 AD双转基因小鼠接受麻醉手术后,在术后早期即可出现认知功能障碍,其发生机制可能与海马区α-突触核蛋白与Aβ42表达异常及神经炎性反应相关.
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α-突触核蛋白在大鼠脑神经元中的亚细胞定位
目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠脑神经元的亚细胞分布.方法 利用2种新的识别不同表位的抗α-SYN单克隆抗体2E3和3D5,应用免疫组织化学、免疫荧光标记和Western blot分析法对α-SYN在大鼠脑神经元的分布进行观察.结果 2E3单抗检测到α-SYN主要存在于神经元的突触前终末;3D5单抗除了能够检测到突触前终末的α-SYNCh,还可以检测到α-SYN在神经细胞核的大量存在.Western blot分析表明,2种抗体在胞质和核组分中均可以检测到一个19 ku的蛋白,与α-SYN的表观分子质量一致.结论 α-SYN免疫活性物质不仅存在于脑神经元的突触前神经末梢,而且也存在于核中,但识别不同表位的抗体对不同亚细胞部位的α-SYN的结合能力不同.
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转染α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞增强对鱼藤酮毒性的耐受
目的探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)在鱼藤酮处理的人类多巴胺能SH-SY5Y细胞内的作用.方法用脂质体转染的方法将α-synuclein基因转染入SH-SY5Y细胞内,并筛选稳定表达α-synuclein的细胞.经过不同浓度的鱼藤酮处理后,测定细胞活力、细胞内氧化应激和抗氧化能力.结果经鱼藤酮处理后,所有的细胞均表现为细胞活力下降和细胞内氧化应激增强.与正常SH-SY5Y细胞相比,过表达α-synuclein的细胞表现为较高的细胞活力和抗氧化能力(P＜0.01).结论α-synuclein过表达可能通过增强SH-SY5Y细胞活力和抗氧化能力,来部分对抗鱼藤酮的毒性作用.
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α-突触核蛋白在帕金森病中的作用
帕金森病(PD)患者的路易小体中存在大量α-突触核蛋白寡聚体.目前认为,寡聚体的形成和增多与氧化应激损伤及氧化修饰息息相关.氧化修饰包括硝化修饰和多巴胺氧化加合.α-突触核蛋白作为分子标志物,可能成为临床治疗帕金森病的新途径.
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α-突触核蛋白过表达对黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶表达的影响
目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响. 方法在α-SYN基因转染的MES 23.5大鼠黑质多巴胺能神经元细胞系,分别用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法分析α-SYN和TH的表达以及两者之间的关系.通过绘制生长曲线和MTT测试细胞氧化还原活性,观察α-SYN基因转染细胞的生长和损伤情况. 结果α-SYN过表达明显抑制MES 23.5多巴胺能神经元的TH表达,但对该细胞的生长和增殖无明显影响,也不引起该细胞损伤. 结论α-SYN过表达对多巴胺能神经元的TH表达具有抑制作用.
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影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究
目的研究影响人α-突触核蛋白(α -synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素,以提高其在原核细胞中的表达量. 方法将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α-大肠杆菌体内,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响,用SDS-PAGE梯度胶电泳分析,考马斯亮蓝染色进行比较研究, 同时检测pH值,观察其变化. 结果诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大,诱导过程中pH值变化较小,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α-突触核蛋白有较大影响.其中,以LB培养基,37℃,180 r/min诱导1～2 h产生α-突触核蛋白的量大 . 结论诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α-突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系.初始菌A590 =0.5～0.8,LB培养基,37℃,大通氧量(180 r/min以上),1～2 h诱导可作为大量提取、纯化α-突触核蛋白的首选条件.
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α-突触核蛋白在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位
目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein)在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位,为阐明其正常的生理功能提供线索.方法超小金标记结合银增强免疫电镜技术.结果α-突触核蛋白不仅存在于神经细胞的突触前终末,也见于神经细胞的轴突、胞浆与核中.在突触前终末,α-突触核蛋白的分布与突触小泡无明显的关系.在神经细胞核内,靠近核膜部分α-突触核蛋白的分布较为密集,细胞核中心部位α-突触核蛋白则较为稀疏.在胞浆和轴突中,α-突触核蛋白散在分布.另外,在线粒体中也有该蛋白表达.结论α-突触核蛋白广泛分布于神经元的各个部位,可能参与神经元的多种生理功能.
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氧化应激诱导多巴胺能MES23.5细胞α-突触核蛋白C-末端片段核转位
目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)和氧化应激的相互作用关系.方法用200μmol/L H2O2处理多巴胺能MES23.5神经细胞作为氧化应激的细胞模型.采用免疫荧光、硫磺素S组织化学染色和免疫印迹技术检测细胞氧化应激反应中α-突触核蛋白的表达状态和亚细胞定位.结果200μmol/L H2O2处理可诱导α-突触核蛋白从细胞浆转位到细胞核内,而且转位到细胞核内的是约10kD的α-突触核蛋白C-末端片段,而存在于细胞浆内的是完整的α-突触核蛋白.硫磺素S染色显示,转位到细胞核内的α-突触核蛋白C-末端片段呈非聚集状态.结论氧化应激可诱导多巴胺能MES23.5神经细胞α-突触核蛋白C末端约10 kD的片段核转位.
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自噬在帕金森病发病中的作用
自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径,主要起着调节性的作用以保护细胞免遭感染、癌症、神经变性、老化,以及心脏疾病等在内的各种病理性损伤,与细胞的存活、分化、发育和内环境稳态的维持密切相关.近来的研究表明,自噬在清除与神经变性疾病相关的错误折叠蛋白和易聚集蛋白方面起关键作用,尤其在帕金森病的发生、发展过程中发挥重要作用.
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α-突触核蛋白和蛋白质降解系统的交互作用
α-突触核蛋白（α-synuclein ）与帕金森病的发病机制有着紧密的联系。α-synuclein 可通过泛素-蛋白酶体途径（ UPS）和自噬-溶酶体途径（ ALP）（主要是大自噬和分子伴侣介导的自噬）进行清除。而这两种主要蛋白质降解途径异常会导致α-synuclein清除受损从而大量沉积。反过来，大量沉积的α-synuclein也会引起其变体的产生，从而产生毒性，这将进一步损伤UPS和ALP功能，出现恶性循环导致神经元的死亡。本文将就以下方面的新发现进行综述：α-synuclein 的降解方式以及α-synuclein对蛋白质降解途径的异常作用。
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慢传输型便秘患者α-突触核蛋白硝基化的意义
目的 探讨α-突触核蛋白(α-Syn)在结肠慢传输型便秘(STC)中的变化及病理学意义.方法 应用免疫荧光双染技术和病理显微分析图像系统,在中倍光镜下比较22例 STC患者(STC组)和20例健康志愿者(对照组)结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn.结果 两组结肠黏膜神经元及胶质细胞均有α-Syn及硝基化α-Syn表达.STC组结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn较对照组明显增加,α-Syn黏膜层 1101.1±26.34 vs.1431.3±30.36; 黏膜下1023.1±31.42 vs.1332.7±26.3;硝基化α-Syn(黏膜层396±14.16 vs.688.5±28.34;黏膜下129.7±3.78 vs.220.9±8.55),差异有显著性(P<0.05).结论 结肠黏膜神经α-Syn的硝基化参与STC的发病.
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SYNC错义突变与遗传性帕金森病的关系
对近年来呈常染色体显性遗传的帕金森患者的临床资料进行回顾,编码 α-突触核蛋白的基因在发生不同种类型的错义突变后,会发生不同程度的聚集,这可能与呈常染色体显性遗传的帕金森病的发病有密切关系.根据二者之间的关系进而为今后的呈常染色体显性遗传的帕金森病的早期预防、诊断以及诊断后干预提供了新的思路.
