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桂枝汤主要成分对PGE2刺激的胚胎大鼠下丘脑神经cAMP-PKA的影响
目的:cAMP-PKA(环磷酸腺苷-蛋白激酶A)是细胞内非常重要的信号转导途径.本实验研究了桂枝汤四个主要组成成分,桂皮酸、桂皮醛、芍药苷及甘草次酸,不同组合对PGE2(前列腺素E2)刺激的胚胎大鼠下丘脑神经细胞内cAMP-PKA水平的影响.方法:用放免法测定不同组合成分作用的细胞cAMP含量和PKA活性.结果:各成分作用时,桂皮酸(0.625μg/mL)、桂皮醛(10、0.625μg/mL)、芍药苷(0.625μg/mL)和甘草次酸(10μg/mL)对细胞cAMP含量或PKA活性有显著的降低作用;在27组不同成分的组合中,有19组对细胞cAMP含量、16组对细胞PKA活性有显著的降低作用.结论:桂皮酸、桂皮醛、芍药苷和甘草次酸的不同浓度组合可能与桂枝汤体温双向调节作用的物质基础有关,其作用可能与调节cAMP-PKA通路有一定的关系.
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体外培养脊髓神经元损伤后c-Jun蛋白表达
目的建立一个模拟脊髓全横断损伤后脊髓组分--原代培养的脊髓神经元损伤的模型.探讨中枢神经损伤后损伤应答基因c-jun的表达及变化.方法取Wistar大鼠(孕14 d)脊髓,培养10～12 d后,采用所设计的标准模板,直视下进行损伤.观察损伤前、后不同时间神经元的形态及即刻早期基因c-jun的表达及变化.结果脊髓神经元损伤10 min后胞核即有c-Jun标记,损伤2 h后多,而且阳性神经元的密度与划痕之间的距离呈明显的反比关系.结论受机械损伤的神经元中,c-jun表达阳性意味着此即刻早期基因产物已进入细胞核内起着"第三信使"的作用.
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嗅神经鞘细胞对胚胎大鼠脊髓后解神经元突起生长的促进作用
实验证实,嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)可促进多种神经元轴突的生长,如背根节神经元、视网膜节细胞以及向脊髓投射的皮层神经元、前庭神经元、中缝核神经元,等等.近年OECs移植用于脊髓损伤后再生研究,已成功促进下行传导路纤维的再生和运动功能的恢复[1].但目前就OECs对脊髓后角神经元的作用目前还缺乏研究.本实验的目的就是观察原代培样的OECs对胚胎脊髓后角神经元的突起生长有无促进作用,从而为进一步的体内移植实验提供依据.
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谷氨酸对胚胎大鼠神经干细胞巢蛋白表达的影响
目的 探讨谷氨酸对体外培养的大鼠神经干细胞巢蛋白(Nestin)的影响.方法 取怀孕10d的SD大鼠胚胎海马组织,分离神经干细胞进行体外培养,置于含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、B27的无血清培养基进行培养.传代至第2代,用免疫荧光细胞化学法检测神经干细胞特异性标志物Nestin的表达;培养液中添加5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)3h后检测其在神经干细胞中的表达;含血清不含神经生长因子的培养液中培养7d后经神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫荧光细胞化学法检测细胞分化情况.细胞传至第3代细胞后,经细胞计数后分为6组,A组为对照组,在B、C、D、E、F组培养液中分别加入浓度为200、400、600、800及1000μmol/L的谷氨酸.观察各组神经干细胞的增殖情况,应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测各组中Nestin表达量的不同,应用统计学软件进行分析.结果 (1)细胞培养:胎鼠海马区分离培养的神经干细胞能很快增殖形成悬浮生长的圆形细胞球.经免疫荧光鉴定,细胞球Nestin抗体标记阳性.在培养液中加入BrdU后,BrdU能结合到细胞核中;诱导分化后,荧光鉴定GFAP标记阳性.(2)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR):Nestin mRNA在各组之间表达亦具有显著差异(P＜0.05),其表达程度由高到低顺序与谷氨酸在各组中的浓度高低相一致:F组(2.2.21±0.42)、E组(1.99±0.37)、D组(1.58±0.26)、C组(1.36±0.41)、B组(1.05±0.34)、A对照组(0.83±0.21).结论 谷氨酸可以促进神经干细胞Nestin的表达,且在一定范围内表达量与谷氨酸浓度存在剂量依赖性.
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BDNF和NT-3对胚胎大鼠脊髓神经元生长发育的影响
为研究脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT-3)对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经元存活和生长发育的影响,在倒置相差显微镜下观察原代培养的神经细胞存活和生长发育情况,计数并进行显微测量.实验数据均以均数±标准差表示,进行方差分析和SNK检验.结果:BDNF和NT-3均能促进培养的胚胎大鼠脊髓神经元的存活,BDNF的作用更显著.两者还促进脊髓神经元的生长发育,BDNF主要促进胞体的发育,NT-3主要促进突起的生长.提示:BDNF和NT-3对培养的胚胎大鼠脊髓神经元的存活和生长发育有促进作用,其作用具有选择性.
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休眠脑细胞的激活及重组重建神经系统功能的实验研究
本研究课题分为以下两个子课题:《大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆的实验研究》和《胚胎大鼠神经干细胞体外黑质细胞定向诱导的实验研究》.
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大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定
目的建立神经干细胞分离、培养、鉴定技术.观察神经干细胞生长、增殖特点.方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察.采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,显微镜下观察到典型的干细胞特征.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞.
关键词： 神经干细胞 细胞培养 胚胎大鼠 荧光免疫细胞化学检测 -
体外骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究
近年来研究结果表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以分化成神经细胞,以及其来源丰富、取材时组织创伤性较小、低免疫排斥反应、不存在伦理道德以及法律上的限制等优势.BMSCs有望成为神经细胞移植的种子细胞来治疗神经系统疾病.音猬因子(SHH)参与调控神经系统的发育、分化过程.维甲酸(RAs) 是维生素A在体内的代谢产物, 在脊椎动物胚胎和神经系统发育、细胞分化中发挥广泛的生理学效应.Forskolin(FN)是一种腺苷酸环化酶的激活剂,它可以升高细胞间的cAMP水平,可以促进轴突的生长延长,促进胚胎大鼠运动性神经元的活性[1].研究表明以上的几种因子组合对BMSCs向神经细胞分化具有协同促进作用,协同作用产生的信号传导通路对BMSCs向神经细胞分化的机制具有至关重要的作用.本文旨在研究诱导后上清液对BMSCs向神经细胞分化中的作用.
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NGF对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响
目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响.方法:在体外分离培养大鼠胚胎中脑神经细胞的培养液中加入不同浓度(10、50、100、200ng/ml)的NGF,培养不同时间,以不如神经营养因子的细胞为对照组,通过MTT法检测细胞活性,神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经细胞,光镜下形态学观察各组大鼠中脑神经细胞体外增殖和分化情况.结果:胚胎中脑神经细胞胞体增大、突起延长且有丰富的神经纤维连结成网络状,细胞集落数增加,显示出剂量-效应关系.结论:一定剂量的NGF能促进大鼠中脑神经细胞分化和增殖,增强其活性.
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Her-2/neu和乳腺癌
1981年,Shih从胚胎大鼠的神经母细胞瘤中克隆了一个新的癌基因,命名为neu.数年后,两个研究小组先后从人cDNA文库中分离出与表皮生长因子受体Her-1的基因高度同源的Her-2,并与逆转录病毒基因v-erb-B2同源的c-erb-B2.
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三碘甲腺原氨酸对大鼠神经元Goα基因表达的影响
目的 分析3,3',5-三碘甲腺原氨酸(T3)对体外培养的大鼠大脑皮层神经元G蛋白Go的α亚单位(Goα)基因表达的影响.方法 取孕19 d的胚胎大鼠大脑皮层神经元,于含15%胎牛血清的DMEM培养基中培养.7 d后神经元分为5组,分别置于不同的培养基:DMEM+15%胎牛血清(A组);DMEM+15%去甲状腺激素的胎牛血清(B组);含0.5 nmol/L T3的DMEM+15%去甲状腺激素的胎牛血清(C组);含5 nmol/L T3的DMEM+15%去甲状腺激素的胎牛血清(D组);含50 nmol/L T3的DMEM+15%去甲状腺激素的胎牛血清(E组).继续培养7 d,收集细胞,抽提总RNA,以竞争性RT-PCR分析各组神经元GoαmRNA水平.结果 B、D和E组神经元Goα mRNA水平显著低于A组(均P＜0.01);C组神经元Goα mRNA水平显著高于A、B、D和E组(P＜0.01);B、D和E组之间则差异元统计学意义(P＞0.05).结论 T3对体外培养的神经元Goα基因的表达有双重调节作用:在一定浓度范围内T3对培养的神经元Goα基因的表达有下调作用;但如果培养基中缺乏T3,神经元Goα基因的表达水平也很低.甲状腺激素对神经元Goα基因表达的调节作用可能是其调节脑发育的机制之一.
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大鼠背根神经节源干细胞分离培养和鉴定
目的:探讨大鼠背根节(DRG)内是否存在神经干细胞.方法:取胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行P75BrdU/Nestin,GFAP,NF200免疫荧光组织化学鉴定.结果:细胞培养获得大量能够分裂增殖且呈巢状悬浮生长的干细胞团,呈P75BrdU/Nestin免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清10d后,相差显微镜下可见部分细胞伸出多个细长突起,且免疫组化呈NF200阳性;部分细胞具有扁平多突起的或双极细胞形态,免疫组化呈GFAP染色阳性.细胞球经NGF培养诱导1d左右有些神经元样的细胞开始迁出,随着时间增长迁出的细胞越来越多,并且细胞和细胞之间发生联系,形成交错的复杂网络,迁出的细胞经免疫组化鉴定几乎都是呈NF200免疫染色阳性.结论:大鼠DRG内存在有神经干细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.
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P311与肾间质纤维化的相关性研究进展
P311是Studler等于1993年首次在胚胎大鼠的脑组织中发现，其广泛表达于体内的多种细胞［1］。P311参与组织修复、瘢痕形成、成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，亦参与肝纤维化的进展。肾间质纤维化是各种肾脏疾病进展至终末期肾脏病的共同途径及主要病理变化，转化生长因子-β1（TGF-β1）是调节肾小管间质纤维化进展的关键细胞因子。在烧伤创面成熟期P311可以下调或抑制 TGF-β1、转化生长因子-β2（TGF-β2）等表达［2］，从而抑制烧伤组织的纤维化，防止其瘢痕的生成。在IgA肾病患者中，P311可以通过与TGF-β1的隐性相关蛋白（LAP）结合从而诱导间质纤维化，参与IgA肾病的进展，提示 P311对肾间质纤维化可能存在着一定的作用。目前国内外关于P311与肾间质纤维的相关性报道较少，作者对此进行了综述。
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胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察
目的:建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法:利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果:从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论:用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.
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碱性成纤维细胞生长因子对胚胎大鼠神经干细胞增殖分化的影响
目的探讨分离、培养及鉴定胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)方法,观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NSCs增殖、分化的影响.方法从大鼠胚胎脑组织中分离出NSCs,用bFGF和胎牛血清诱导其增殖和分化,予BrdU以标记分裂细胞,采用免疫细胞化学鉴定NSCs和分化神经细胞.结果大鼠胚胎脑NSCs在无细胞因子和胎牛血清的培养基中无新生细胞形成,但能在bFGF和血清诱导下形成克隆,并产生nestin和Br-dU阳性细胞,贴壁后分化为神经元和星形胶质细胞.结论该方法从大鼠胚胎大脑分离出的细胞具有NSCs特性,即自我更新和多向分化潜能;bFGF是NSCs增殖必须的丝裂原.
关键词： 神经干细胞 细胞培养 碱性成纤维细胞生长因子 细胞分化 胚胎大鼠 -
胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定
目的: 探索胚胎大鼠神经干细胞培养、传代及鉴定方法.方法:从胚胎大鼠脑室下区(SVZ)组织分离得到神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养,并诱导分化,采用SABC法对分化后的细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸蛋白(GFAP)检测及姬姆萨染色进行细胞鉴定.结果:成功培养出了胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞.结论:胚胎大鼠神经干细胞在体外适宜的培养条件下具有自我更新、增殖和多向分化潜能.
关键词： 神经干细胞 胚胎大鼠 细胞培养 碱性成纤维细胞生长因子 -
胚胎大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定及标记
目的:探索胚胎大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记的方法.方法:分离胚胎大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;5-溴脱氧尿嘧啶(BrDU)掺入试验,并用免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况.采用荧光染料Hoechest33342标记神经干细胞并诱导其分化,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞.结果:①获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养8代后仍具干细胞特性;②荧光染料的标记率可达97%,细胞传8代后荧光亮度无明显衰减,并且分化后的细胞核中仍有荧光表达.结论:成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及核多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞;荧光染料的标记可获得较高的标记率,可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞.
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胚胎大鼠脑室下区神经干细胞透射电镜超微结构
目的 探寻用透射电镜显示超微结构识别胚胎大鼠脑室下区神经干细胞的新方法.方法 将培养了24 h已贴壁生长的胎鼠脑室下区神经干细胞(已经免疫组化方法鉴定证实)经0.125%胰蛋白酶消化,待光镜下见细胞回缩,胞体变圆,细胞间隙变大时,立即加入胎牛血清终止消化,经1 000 r/min×10 min离心沉淀,收集细胞于离心管内,弃上清后,经3.5%戊二醛、1%锇酸双固定、丙酮酸逐级脱水、618环氧树脂包埋、超薄切片后柠檬酸铅、醋酸铀双染色后透射电镜观察、摄片.结果 原代培养24 h的脑室下区神经细胞标本透射电镜下观察、摄片,见部分细胞体积较小,胞核大,核染色质丰富,胞质少,胞质内见大量游离核糖体,线粒体多见,其它细胞器少见.根据其细胞器幼稚,尚未发育成熟的特点,提示该类细胞为幼稚细胞,结合免疫组化实验,确定为胚胎大鼠脑审下区神经干细胞.结论 透射电镜显示胚胎大鼠脑室下区神经细胞超微结构是除免疫组化外识别该神经细胞的另一种新方法,值得借鉴和推广.
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胚胎大鼠神经干细胞体外黑质细胞定向诱导的实验研究(摘要)
目的:探寻体外定向诱导胚胎大鼠神经干细胞向黑质细胞分化的新方法.方法:用成年大鼠黑质匀浆液(HSN)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及HSN+bFGF对取自胎龄期12～16d(E12-16)胚胎大鼠脑室下区培养的神经干细胞(经Nestin抗体免疫组化及透射电镜证实)进行体外诱导培养48?h后,以酪氨酸羟化酶(TH)单抗免疫组化检测其是否向黑质细胞分化(设空白对照组);并用荧光分光光度法测定HSN+bFGF诱导后0,24,48h神经干细胞培养液中多巴胺含量,数据分析采用配对t检验分析(自身对照).结果:(1)HSN+bFGF诱导组,TH单抗免疫组化出现阳性细胞;(2)HSN+bFGF诱导后,0,24,48h多巴胺含量对比分析;48h与24h(P<0.01),48h与0h(P<0.05)相比,多巴胺含量增加,而24h与0h(P>0.05)相比则无增加趋势.结论:(1)用成年大鼠黑质匀浆液+bFGF能定向诱导神经干细胞向黑质细胞分化;诱导而成的黑质细胞已具有多巴胺分泌功能,诱导后24～48h为多巴胺分泌的一个峰值;(2)透射电镜显示神经干细胞超微结构是除免疫组化外鉴定神经干细胞的另一种方法.
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胚胎大鼠脑室下区神经细胞体外培养和向黑质细胞定向诱导的实验研究
本研究目的在于探寻体外培养和定向诱导胚胎大鼠脑室下区(SVZ)神经细胞向黑质细胞分化的新方法.采用成年大鼠黑质匀浆上清液(HSN)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及HSN+ bFGF对取自胎龄期12～16 d(E12～E16)胚胎大鼠SVZ培养的神经细胞(经nestin抗体免疫组化及透射电镜识别)进行体外诱导培养48 h后,以TH单抗免疫组化方法检测其是否向黑质细胞分化;并用荧光分光光度法测定HSN+bFGF诱导后0、24、48 h SVZ神经细胞培养液中多巴胺含量.结果显示:(1)HSN+bFGF诱导组,TH单抗免疫组化出现阳性细胞;(2)HSN+bFGF诱导后0、24、48 h多巴胺含量对比分析:48 h与24 h(P<0.01)、48 h与0 h(P<0.05)相比,多巴胺含量明显增加,而24 h与0 h相比则无增加趋势(P>0.05).以上结果表明:(1)用成年大鼠HSN+ bFGF能定向诱导胚胎大鼠SVZ神经细胞向黑质细胞分化,诱导而成的黑质细胞已具有多巴胺分泌功能,诱导后24～48 h为多巴胺分泌的一个高峰;(2)透射电镜显示胚胎大鼠SVZ神经细胞超微结构是除免疫组化外识别该神经细胞的另一种新方法.
关键词： 体外定向诱导 碱性成纤维细胞生长因子 黑质匀浆液 脑室下区 胚胎大鼠
