首页 > 文献资料
-
087 端粒、端粒酶与癌变
端粒是真核细胞染色体末端的一种保护性结构，与端粒酶一起具有维持基因组稳定和决定细胞寿命的作用。研究表明端粒酶激活是多种细胞癌变的一个重要环节，且该环节可处在整个癌变过程的早期或晚期，其作用在于维持癌变细胞的永生性。
-
1-02 塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化*
目的研究塞替派对人类上皮细胞的致癌转化效应.方法利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为基本细胞模型,首次进行了塞替派诱导BEAS-2B细胞的恶性转化实验;平行于细胞的转化进程研究了塞替派转化细胞(BEAS-TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征.结果经传代和软琼脂培养基筛选BEAS-TE已具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性,可能是具有较强裸鼠致瘤性的恶性转化细胞.结论塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应.
-
端粒酶对细胞周期调控和肿瘤发生的影响
自端粒酶发现至今的十几年中,人们对其结构和功能进行了系统的研究,发现端粒酶与肿瘤发生具有明显的关联.肿瘤细胞具有细胞周期失调的共同特点,而正常细胞脱氧核糖核酸在受到损伤后能够发生细胞周期阻滞以及时修复损伤,即通过细胞关卡调控,这是保持基因组稳定的关键事件.细胞周期关卡调节异常可导致遗传改变,并可能导致细胞的恶性转化.本文就端粒酶激活、细胞周期失调对肿瘤形成的影响以及两者之间关系的研究做一综述.
-
永生化软骨细胞为基础的工程化软骨修复软骨缺损的实验研究
目的探讨用永生化软骨细胞作为种子细胞修复羊关节软骨缺损的可行性.方法把人端粒酶催化亚基(hTERT)转染羊关节软骨细胞,筛选阳性克隆并通过旋转生物反应器-微载体技术进行大量扩增;将扩增的永生化软骨细胞与β-磷酸三钙复合并在体外培育后,植入羊前肢肱骨头关节面软骨缺损处;3和6个月取材,进行形态学和免疫组织化学评价.结果实验组,术后6个月,缺损区被新生的软骨组织所充填,Ⅱ型胶原染色呈强阳性,与对照组差别有显著性差异(P＜0.01).在材料组,缺损区边缘可见部分新生软骨组织;空白对照组,缺损区新生软骨组织形成.结论永生化软骨细胞在软骨组织工程中具有潜在的应用前景.
-
人乳头状瘤病毒诱导食管上皮永生化细胞的双相分化
研究中期永生化食管上皮细胞的表型、细胞遗传学和部份基因J的改变,以阐明癌前病变的特征.SHEE是该院用人乳头状瘤病毒HPV18E6E7诱导的永生化上皮,传至61代已开始有少量细胞恶性转化.对永生化中期31代培养细胞用相差显微镜检查细胞形态改变和细胞生长状态(细胞接触抑制和锚定生长);流式细胞仪检测细胞周期;做染色体众数分析;多重PCR检查c myc、p53、bcl 2和ras等基因.免疫组化检查细胞角蛋白和鬼臼毒素荧光标记检查肌动蛋白F(F actm).软琼脂培养的集落细胞接种SCID小鼠检查成瘤性.Western blot方法检测细胞内HPVE6表达蛋白.结果:培养细胞有两种不同分化形态,分化差的基底细胞和分化好的鳞状上皮;前者角蛋白和F-actin极少,后者含量丰富;细胞接触抑制和锚锭生长特性减弱.分析100个细胞染色体众数分二干系,56条(占30%)和61条(占24%)染色体,核型分析属于超二倍体,亚三倍体.多重PCR检查:c-myc、p53基因上调,6cl 2和rad基因阳性.用优选生长在软琼脂上的克隆细胞接种SCID小鼠,未成瘤;HPV18E6表达蛋白阳性.以HPV18E6E7诱导的食管永生化上皮31代细胞形态出现了双向分化,根据其形态表型,双染色体众数的细胞遗传学改变和某些癌基因上调等特性,可以认为SHEE31细胞是处于癌前改变.
-
人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化
为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞(SHEE)61代(SHEE61)部份细胞(SHEE61A)已经恶性转化,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法.对培养的SHEE第10代(SHEE10)和61代(SHEE61)细胞,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式;用流式细胞仪分析细胞周期;用染色体G带核型分析和间期核染色体1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交(FISH)检测细胞染色体改变;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体,接种裸小鼠和SCID小鼠.结果:光学显微镜下见SHEE61细胞大小不等,重叠生长;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型;流式细胞仪检测,SHEE61增殖指数和DNA＞4n细胞高于SHEE10;SHEE61细胞染色体众数出现57～60、63～65两亚群,1、7、9、13、17等染色体出现较多3体、4体或5体;FISH间期核1、7号着丝粒数增多;SHEE61克隆优选的细胞SHEE61A接种SCID小鼠成瘤.这表明:SHEE61细胞形态及生长特性有了改变,接触抑制减弱,高倍体和不整倍体细胞增多,染色体数目明显改变,SHEE61A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤,可以判定SHEE61部份细胞已恶性转化.用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化.
-
温度敏感型基因永生化神经前体细胞系的建立
目的建立温度敏感型永生化神经前体细胞系,鉴定其细胞生长特点及表达抗原的特性. 方法利用逆转录病毒感染原代培养的胚胎13d SD大鼠中脑神经前体细胞,建立温度敏感型永生化神经前体细胞系RMN,利用免疫细胞化学、Western blot和流式细胞分析方法测定RMN细胞的特征. 结果在33℃条件下,RMN细胞呈多边形,有较短突起;细胞增殖迅速,群体倍增时间为48 h,可连续传代和冷冻保存;细胞表达SV40大T抗原,nestin蛋白和Nurrl蛋白;RMN细胞中未发现染色体倍体的异常,裸鼠接种20周后未观察到肿瘤的形成.在39℃条件下,RMN细胞增殖速度减缓,细胞形成较长突起.在含1%胎牛血清的培养基中培养1周后,RMN细胞可表达β-Ⅲ-tubulin,GFAP和Gal C等抗原,但SV40抗原表达减弱.结论RMN细胞系是SV40/tsA58基因永生化的大鼠神经前体细胞系,是具有温度敏感性及多分化潜能的前体细胞系.
-
HPV18永生化人胚食管上皮细胞的细胞遗传学研究
目的研究HPV18永生化人胚食管上皮细胞的细胞遗传学改变,为深入研究食管癌发病机理提供实验依据. 方法采用Giemsa染色、G显带、间期核荧光原位杂交(FISH)分析人胚食管上皮永生化细胞株(SHEE)染色体数目异常和结构畸变. 结果人SHEE第10、20代细胞染色体众数分别为58～63、57～64,第61代为双众数:58～60、63～65.G显带发现,在大多数核型中出现异常染色体:1.del(1)(q12);2.del(1)(p32);3.der(4),t(4;?)(q31;?);4.der(5),t(5;?)(q31;?).FISH结果显示,1号3体和7号4体伴随传代数目增加而明显增加.8号2体保持相对恒定. 结论 SHEE细胞伴随传代数目增加,染色体众数有双众数分布倾向,染色体数目异常表现为不平衡增加,结构异常的染色体恒定存在,提示细胞的永生化是一个由多染色体参与的多阶段过程.
-
外源性端粒酶催化亚基不影响人骨髓间充质干细胞的特性
目的 研究稳定表达端粒酶催化亚基的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)生物学特性. 方法 用含有人端粒酶返转录酶(hTERT)基因的反转录病毒质粒pBabepuro-hTERT感染hBMSCs,经嘌呤霉素(puro)筛选出转基因细胞,我们将其命名为hTERT-hBMSCs.采用TRAP-ELISA法检测hBMSCs细胞转染前后端粒酶活件的变化;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,染色体核型分析,测量平板克隆形成率,成骨诱导等方法 对hTERT-hBMSCs细胞生物学特性进行分析. 结果 TRAP-ELISA法检测转染hTERT的hBMSCs的端粒酶为阳性;hTERT-hBMSCs细胞表面抗原CD44表达阳性,CD34阴性;hTERT-hBMSCs比hBMSCs增殖活跃,目前已传了11代,尚未见衰老迹象,其染色体数目和结构正常,未见畸变;克隆形成率较低,为正常细胞;并保持于细胞成骨分化潜能.结论 将外源性hTERT基因转入hBMSCs后,不影响其生物学特性和分化功能.
-
有机硒对恶性转化人胚食管上皮永生化细胞系作用的实验研究
一、材料与方法1.材料:H5E973细胞系[1]由本院沈忠英教授提供;亚硒酸钠(天津市化学试剂研究所),分析纯;硒-甲基硒代半胱氨酸(MSC)(美国Sigma 公司),分析纯.TUNEL试剂盒(美国Promega公司).
-
SFTS病毒感染脾脏网状成纤维细胞系的建立
目的 分离、纯化、培养和永生化小鼠脾脏原代网状成纤维细胞(fibroblastic reticular cells,FRCs),筛选和鉴定永生化的FRCs克隆,证明永生化FRCs可用于SFTS病毒(SFTSV)体外感染研究.方法 使用磁珠和流式细胞分选等技术分离、纯化和培养小鼠脾脏FRCs;使用SV40永生化FRCs,筛选单克隆并培养50代以上,使用转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq)和激光共聚焦技术对原代和永生化的FRCs进行比较和鉴定;用SFTSV体外感染的永生化的FRCs.结果 成功得到4个永生化的FRCs克隆;鉴定结果显示Clone02符合FRCs表型,且纯度均达到了99％;转录组测序相关性分析显示Clone02细胞株基因表达与原代FRCs接近;基因表达分析和激光共聚焦实验证实Clone02的表型和原代FRCs相同;SFTSV在MOI值0.5的条件下即可成功感染Clone02细胞.结论 永生化的FRCs Clone02细胞保持了原代细胞的形态学、免疫学特征,与原代FRCs基因表达谱接近,可被SFTSV体外感染,是一个新的有潜力的SFTSV体外研究的细胞平台.
-
潜伏膜蛋白1基因特异性沉默对EB病毒阳性胃上皮细胞影响的初步研究
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是重要的DNA肿瘤病毒.潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1,LMPl)编码基因是EBV永生化基因中惟一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使之具有致瘤性的基因.
-
c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系的建立与鉴定
目的：通过在c-kit突变型人胃肠间质瘤原代细胞中过表达人端粒酶逆转录酶（ hTERT），建立c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系。方法利用聚合酶链反应（ PCR）技术获得hTERT目的基因片段，测序正确后，体外构建端粒酶亚单位（ hTERT）逆转录病毒表达载体，转染c-kit突变型胃肠间质瘤原代细胞，通过RT-PCR及western bloth技术检测hTERT在原代细胞内的表达变化，选取hTERT表达升高的细胞，利用有限稀释法获得高表达hTERT的单克隆细胞株。结果实验中成功获得hTERT目的基因片段，获得的细胞株与原代细胞相比hTERT表达上调，且体外传代50次后依然保持很好的细胞形态及活力。结论成功获得c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系，为进一步研究c-kit突变对胃肠间质瘤的影响奠定基础。
-
人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建
目的:构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株.方法:采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcD-NA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST).经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养.采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(L-EK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功.结果:重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE亚克隆成功.Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,L-EK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的L-EK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P＜0.01).IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPE mRNA表达水平和培养上清液中L-EK的分泌量明显增高(P＜0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P＞0.05).结论:成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础.
-
Plenti6.3/V5-TERT慢病毒载体的构建并成功建立永生化大鼠骨髓间充质干细胞系的研究
目的 为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选TERT基因稳定整合的骨髓间充质干细胞,首先对pCI-neo-TERT质粒进行了改造和构建.方法 将pCI-neo-TERT酶切后得到TERT片段,并进行PCR扩增,将得到的TERT片段连入Plenti6.3/V5,酶切鉴定载体构建正确后,将改造和构建载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK-293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞,验证抗性基因的插入.结果 成功构建了重组慢病毒载体Plenti6.3/V5-TERT,通过调整病毒上清的用量可以使靶细胞达到很高的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达.结论 我们成功构建了慢病毒载体Plenti6.3/V5-DEST-TERT,从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合TERT的骨髓间充质干细胞成为可能.
-
病理性瘢痕治疗与展望
增殖性瘢痕常发生于深Ⅱ度烧伤自行愈合的部位,此外也见于普通切口缝合后的切缘上.其特点是瘢痕高出皮面,形状不规则,潮红充血,质坚韧,不向周围生长扩张,往往在延续数月或数年以后开始逐渐发生退化,软化变平,颜色转淡.瘢痕疙瘩是一种过度增生的异常瘢痕组织,隆起于皮肤表面,其内有大量胶原和基质成分的沉淀和毛细血管的再生,且向周围正常皮肤浸润,术后易复发,并有永生化倾向[1-2].
-
实时荧光定量PCR测定人乳头状瘤病毒16型E7基因方法学的建立及其在宫颈疾病诊断中的应用价值
宫颈癌是世界妇女第2高发肿瘤,每年新发病例493 000人,并导致274 000人死亡[1].高危型人乳头状瘤病毒(HPV),尤其是HPV16型,在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用[2].病毒早期,E7基因是导致宫颈上皮细胞恶性转化和永生化的重要因素[3],其编码的E7蛋白通过与pRb结合,干扰细胞周期调控及DNA修复,从而使细胞不稳定性增加[4].
-
稳定表达人乳头瘤病毒16型E7癌基因HaCaT细胞系的建立及其研究
官颈癌是世界第二大妇女常见肿瘤[1].大量流行病学和分子生物学研究证实高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV),尤其是HPV16型在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用[2-3].HPV16型E7基因编码蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关,在维持转化组织恶性表型的过程中发挥重要作用.本研究选择与官颈卜皮细胞相似的非肿瘤性人永生化表皮细胞(HaCaT)作为研究对象,通过真核表达载体pCMV将HPVl6 E7基因导人HaCaT细胞,使HPV16 E7在HaCaT细胞中表达,探讨其对HaCaT细胞的增殖、周期及HLA-Ⅰ类分子表达的影响.
-
永生化骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的:探讨永生化骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)的生物学特性.方法:通过质粒pCMVSV40T/PUR导入大鼠BMSCs,建立永生化BMSCs.在倒置显微镜下观察细胞形态;采用检测碱性磷酸酶的活性,了解永生化BMSCs是否可分化为成骨细胞;采用裸鼠皮下接种实验检测细胞的致瘤性;应用不同血清浓度进行细胞培养及冻存,描绘其生长曲线及复苏后的活性.结果:未导入质粒的BMSCs培养至15代后细胞不能继续传代,呈明显衰老迹象,而永生化BMSCs培养至5代后仍可保持较好的活性,但具有明显接触抑制;永生化BMSCs具有分化为成骨细胞的能力:裸鼠接种后无致瘤性;与其他血清浓度相比,20%血清培养组的细胞生长速度较快;50%及90%血清组其复苏后较20%血清组活性高(P<0.05).结论:在体外,pCMVSV40T/PUR构建的永生化BMSCs具有活性较好等特性,且无成瘤性.可为BMSCs的研究及应用提供大量的细胞来源.
-
肝细胞永生化:进展与挑战
基于活性肝细胞为主要生物成分的肝细胞治疗学已逐渐成为治疗肝衰竭及先天性肝脏代谢性疾病的重要手段,但其关键是获得理想的肝细胞材料.肝细胞永生化是解决肝细胞来源的重要途径之一,这一领域的研究进展较为迅速.目前已经建立的肝细胞株包括肿瘤源性肝细胞株、由正常肝细胞经胶原凝胶夹心培养系统培养后而获得的肝细胞株、由正常肝细胞经转染/转导而获得的肝细胞株,以及p53或p19基因敲除而建立的肝细胞株等.上述肝细胞株多由肝肿瘤细胞衍变而来或经病毒转导而获得,因此存在安全性之虑.另外,多数肝细胞株的分化功能与原代细胞相比有不同程度地下降.为克服上述缺陷,国内外学者开始采用可回复性永生化方法,其基本原理是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株,使其获得体外增生能力,然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因,使细胞株回复到永生化前的状态.这样,肝细胞株既具有了永生化特性,又可解决安全性与分化功能差的缺点.从这一技术的发展现状及趋势看,进一步改善载体设计将是近期研究的热点.
