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中药清毒栓对HeLa细胞MHC-Ⅰ抗原呈递通路相关分子表达的影响
目的:探讨中药清毒栓治疗宫颈高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的分子机制.方法:以HPV18阳性的宫颈癌细胞系HeLa为细胞模型,清毒栓水提醇沉液、β-榄香烯、干扰素α-2b进行干预;分别采用Western blot 及Real-time PCR检测主要组织相容性复合物-Ⅰ (MHC-Ⅰ)抗原呈递通路相关分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白及基因表达差异.结果:与对照组相比,清毒栓及β-榄香烯均可显著上调HeLa细胞内抗原呈递通路相关分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白表达(P＜0.05),清毒栓可上调4种分子的基因表达(P＜0.05),β-榄香烯仅能可上调TAP2的基因表达(P＜0.05),干扰素q-2b对该4种分子的基因表达无影响.结论:中药清毒栓可通过调节抗原呈递通路相关分子的蛋白及基因表达,起到促进抗原呈递的作用,这可能是该方疗效的作用机制之一.
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Survivin在中线T细胞淋巴瘤中的表达及其与EB病毒感染的关系
为了探讨凋亡抑制基因存活蛋白(survivin)在中线T细胞淋巴瘤(midline T-cell lymphoma,MTL)中的表达及其与EB病毒(Epstin-Barr virus,EBV)感染的关系,应用免疫组织化学方法检测石蜡切片中存活蛋白和EBV潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP-1)的表达,采用原位分子杂交技术检测EBV编码的RNA(EBV-encoded RNA,EBER1/2).结果表明:41例MTL中26例存活蛋白阳性表达(63.42%),而在10例反应性增生淋巴组织中均未检测出存活蛋白表达;存活蛋白在低度恶性MTL中的阳性表达率为12.50%,在中-高度恶性MTL中的阳性表达率为75.76%,两组之间的差异具有显著性的意义(x2=8.55,P＜0.01);EBER 1/2阳性率为70.73%,LMP-1阳性率为41.46%,EBV阳性组与EBV阴性组之间存活蛋白的表达差异无显著性意义(P＞0.05).结论:MTL组织中存活蛋白表达上调,存活蛋白表达阳性率与MTL的恶性程度有关,存活蛋白基因可能通过肿瘤细胞凋亡的抑制参与MTL的发生发展,但未发现存活蛋白表达与EBV感染之间有明显相关性.
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EB病毒潜伏膜蛋白LMP1有关信号传导通路的研究进展
EB病毒的致癌性与细胞源性基因和潜伏感染基因有关,其中潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)家族LMP1、LMP2A、LMP2B可干扰信号传导通路并诱导B细胞转化.在EB病毒潜伏感染期所表达的核蛋白和膜蛋白中,LMP1因为能够诱导啮齿动物纤维母细胞系的癌基因转化而引起人们的广泛兴趣.人们发现LMP1高表达与细胞高活性之间有密切关系,如纤维母细胞系癌基因转化、抗凋亡蛋白上调和细胞表面标志及细胞因子产生、上皮细胞分化抑制等[1].LMP1能使啮齿动物的成纤维细胞永生化,失去接触抑制功能,锚定非依赖性生长并对裸鼠产生致瘤性[2].自1995年以来,关于LMP1信号传导的研究取得了重要进展,然而LMP1是通过何种途径引起这些效应,目前尚未完全明了,其信号传导过程仍然是目前研究的重要课题.
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LMP1基因重组慢病毒载体的构建及表达性能鉴定
为了进一步探讨EB(Epstein Barr)病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的作用机制及其功能,我们构建了EDL2-N-LMP-慢病毒载体,并对所构建的EDL2-N-LMP-慢病毒载体结构及表达进行鉴定.
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潜伏膜蛋白1基因特异性沉默对EB病毒阳性胃上皮细胞影响的初步研究
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是重要的DNA肿瘤病毒.潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1,LMPl)编码基因是EBV永生化基因中惟一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使之具有致瘤性的基因.
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EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析
目的 对EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a(+)得到pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2(aa195-232)和LMP2(aa419-436)肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比(1:5,1:10,1:25)增加,CTL杀伤活性逐渐增强(12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%),同时产生了特异性血清IgG抗体反应(A490=0.258±0.040),与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究没计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.
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儿童NK/T细胞淋巴瘤与survivin基因的表达
NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma)是一种少见的结外原发性非霍奇金淋巴瘤,是与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)相关的具有高度侵袭性的恶性肿瘤.survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAP)家族的新成员,主要通过抑制caspase-3、caspase-7的活性而发挥抗凋亡作用 [1,2].我们采用原位杂交技术检测EBV编码的RNA(EBER1/2),免疫组织化学技术检测survivin基因和EBV潜伏膜蛋白(LMP-1)表达,以探讨NK/T细胞淋巴瘤与survivin基因表达的关系.
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鼻咽癌CNE1细胞株中EB病毒LMP1 cNDA的克隆及LMP1胞外段稳定性研究
目的:克隆鼻咽癌细胞株CNE1中EBV-LMP1 cDNA,载入质粒载体pGEM中,并检测CNE1细胞株LMP1胞外肽段表达的稳定性.方法:运用免疫组化的方法检测CNE1细胞潜伏膜蛋白(LMP1)的表达情况,通过RT-PCR技术从CNE1细胞中扩增EBV-LMP1基因全长,并载入质粒载体pGEM,转化JML09菌.提取质粒,利用引物上的BamH1与Hind3酶切位点限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定.扩增CNE1细胞中含有LMP1三段胞外段的序列并测序.结果:免疫组化显示CNE1细胞高表达LMP1,扩增的LMP1 cDNA长度为1158 bp,测序结果与已知序列有部分变异.连续传代的CNE1细胞LMP1胞外段表达稳定.结论:成功克隆了EBV-LMP1 cDNA,并载入质粒载体,证实LMP1胞外段表达稳定,为研究LMP1在鼻咽癌致病机制中的作用,并进一步研制LMP1胞外段特异性单克隆抗体,为其在鼻咽癌放疗靶区功能显像的研究中奠定基础.
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EB病毒与淋巴瘤关系的研究
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种嗜人类淋巴细胞的DNA疱疹病毒,EBV在正常人群中感染非常普遍,约90%以上的成人血清EBV抗体阳性.国内外众多研究结果表明,EBV与多种人类肿瘤有关,如传染性单核细胞增多症、淋巴瘤、鼻咽癌等疾病;其中Burkitt's淋巴瘤和鼻咽癌的密切相关性已被公认[1];EBV与霍奇金淋巴瘤及T、B细胞淋巴瘤均有关,现仅就不同的细胞属性和不同组织学类型的淋巴瘤与EBV关系的研究综述如下.
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免疫组化、原位杂交及PCR法检测霍奇金淋巴瘤石蜡组织中EB病毒
霍奇金淋巴瘤(HL)与EB病毒(EBV)密切相关[1,2].然而,不同作者所报道HL中EBV的检出率为20%～95%[1,2].为探讨造成差异的原因,我们选取广东地区39例HL蜡块组织,采用3种常用的EBV测定方法--PCR检测EBV的DNA、免疫组织化学检测EBV潜伏膜蛋白1(Latent membrane proteins,LMP1)、原位杂交检测EBV编码的mRNA(Epstein-stein-Barr Encoded RNAs1,EBER1),进行了比较研究.
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LMPs特异性T淋巴细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用
目的:研究树突状细胞负载EB病毒潜伏膜蛋白(latent membrane proteins,LMPs)介导生成的LMPs特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)LMPs-CTL的生物学特性,观察其对LMPs阳性鼻咽癌细胞SUNE的杀伤作用.方法:用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,采用贴壁分离及白细胞介素(interleukin,IL)-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC),通过DC细胞负载LMPs多肽抗原并递呈给同源T淋巴细胞,制备LMPs-CTL.CCK8法检测LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤作用;ELISA和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxy fluoroscein succinimidyl ester,CFSE)染色法检测LMPs-CTL分泌IFN-γ及其增殖.结果:LM Ps-CTL对SUNE细胞的杀伤率在12h和24 h分别为(43.47±1.93)％和(77.15±3.18)％,显著高于对照组的(11.45±3.06)％和(24.27±13.20)％(P＜ 0.05).SUNE细胞刺激后,LMPs-CTL增殖能力较对照组有明显增强,IFN-γ分泌量达到(613.40±121.77) pg/ml,显著高于对照组(86.90±3.70) pg/ml(P＜ 0.05).结论:通过DC细胞负载LMPs混合多肽可诱导生成LMPs-CTL,对LMPs阳性鼻咽癌细胞有较强的杀伤作用.
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LMP-1、VEGF在非角化性鼻咽癌中的表达及其意义
目的:探讨潜伏膜蛋白(LMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)在非角化性鼻咽癌(NK-NPC)中的表达及临床意义.方法:采用免疫组织化学技术(ENVISION二步法),检测60例鼻咽癌组织中LMP-1、VEGF蛋白的表达,并分析其与癌预后的相关性.结果:(1)NK-NPC中LMP-1、VEGF的表达显著高于鼻咽慢性黏膜炎症组织(P<0.05);(2)NK-NPC中,LMP-1表达强度与有无远处转移密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄、T分期、N分期无显著相关性(P>0.05);(3)NK-NPC中.VEGF表达强度与淋巴结转移,远处转移密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄、T分期均无显著相关性(P>0.05);(4)NK-NPC中LMP-1与VEGF的表达呈正相关关系(P<0.05);(5)单因素Kaplan-Meier生存曲线分析LMP-1、VEGF表达与NK-NPC的生存率之间的相关性有显著统计学意义(P<0.05).结论:LMP-1和VEGF可作为诂价NK-NPC预后的指标之一.
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EBV潜伏膜蛋白2的结构与功能分析
目的:预测和分析EBV潜伏膜蛋白2(LMP2)的结构和功能.方法:采用互联网数据库和生物软件,从SwissProt蛋白质数据库中检索LMP2的氨基酸序列,通过生物软件分析预测其理化性质、二级结构及空间结构.结果:分析显示LMP2由497个氨基酸组成,分子量53 011.4 Da,等电点4.85,为疏水性蛋白;具有12个疏水跨膜区,其N端含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)和脯氨酸富集基序(PY基序),前者位于氨基酸序列74～77和85～88处,后者位于56～60和97～101处;含有15个α螺旋结构和7个β片层结构,通过无规则卷曲连接α螺旋和β片层.结论:通过对LMP2生物信息学的分析,获得了此蛋白的理化特性及部分参与调节跨膜信号传导功能区的信息,为进一步研究EBV的感染与致病机制、研制EBV亚单位疫苗等奠定基础.
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EB病毒与霍奇金淋巴瘤关系的研究进展
Epstein-Barr病毒(EBV)初是由Epstein和Barr从非洲Burkitt淋巴瘤培养细胞中发现的1种独特的疱疹病毒.它广泛存在于人群中,血清学、流行病学及分子生物学的研究表明EBV与人类的多种疾病密切相关,包括传染性单核细胞增多症、部分类型的淋巴瘤、鼻咽癌等疾病.近年来,人们逐渐认识到EBV与霍奇金淋巴瘤(hodgkin's lymphoma,HL)关系非常密切[1],在这方面做了不少研究工作.我们就EBV与HL研究的新进展作一综述.
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EB病毒潜伏膜蛋白对鼻咽上皮细胞生物学表型的影响
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种全球性分布、人群感染率颇高的具有致瘤潜能的DNA疱疹病毒,90%以上的人群建立了EBV终生潜伏状态感染.目前的研究发现其致瘤谱越来越广,除与传染性单核细胞增多症相关外,还与某些恶性淋巴瘤(Burkitt淋巴瘤,霍奇金病,某些T、B细胞源性非霍奇金淋巴瘤如血管中心性淋巴瘤、间变性大细胞性淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、器官移植后及免疫缺陷者淋巴瘤等)、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、喉癌、宫颈癌等恶性肿瘤相关.近年来,国内外对EBV的基因表达与肿瘤发生之间的关系做了大量工作.研究较清楚的EBV基因产物主要有6种核抗原(EBNA1～6)、3种潜伏性膜蛋白(LMP1、LMP2A和LMP2B)和2种小核糖核酸(EBER1和EBER2),其中LMP1是迄今唯一被确证的EBV基因致瘤产物,因此其生物学功能已成为EBV的研究热点.
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鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白的表达变化及意义
EB病毒编码的潜伏膜蛋白(LMP1)是目前惟一被证实具有转化上皮细胞功能的基因产物.2006年10月～2008年9月,我们检测了鼻咽癌组织中的LMP1,并探讨其与鼻咽癌发生发展的关系.现报告如下.
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三氧化二砷抑制人鼻咽癌细胞侵袭的体外实验研究
目的观察三氧化二砷(As2O3)对人鼻咽癌细胞株HNE1-LMP1侵袭、转移的影响.方法鼻咽癌细胞在含3 μmol/L的As2O3培养基中培养48小时,然后在无含砷的培养基中继续培养48小时后,收集此时间点贴壁的细胞作为研究对象;用细胞-基质黏附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测As2O3对HNE1-LMP1细胞黏附、运动及侵袭能力的影响;用激光共聚焦的方法检测EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达情况.结果肿瘤细胞-基质黏附实验结果显示,经As2O3处理的HNE1-LMP1细胞,其黏附能力(平均吸光度为0.524±0.09)低于对照组细胞(平均吸光度为0.665±0.14),两者相比有差异(P<0.05).运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭结果均显示,经As2O3处理后,穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(PVP-F)的肿瘤细胞数明显减少(P<0.01),同时As2O3能够下调LMP1的表达. 结论 As2O3具有抗人鼻咽癌细胞株转移的潜力,其机制可能与抑制LMP1的表达相关.
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鼻咽癌组织LMP-1表达与外周血EBV-IgA/VCA的关系
目的 研究鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)患者 Epstein-Barr 病毒(EBV)感染及潜伏膜蛋白 1(1a-tent membrane protein-1,LMP-1)表达的情况.方法 采用免疫组化实验技术对 62 例鼻咽癌活检组织及 33 例慢性鼻咽炎组织中 LMP-1 的表达进行检测,同时采用免疫酶标法对这些患者外血 EBV 的 IgA/VCA 抗体进行检测.结果 外周血 EBV-IgA/VCA 检出总阳性率在 NPC 患者中为 90.32%(56/62),在慢性鼻咽炎患者中为 3.03%(1/33),两者之间差异具有显著性意义(P<0.05);LMP-1在NPC组织中表达的总阳性率为 59.68%(37/62),在慢性鼻咽炎组织中表达的阳性率为 6.06%(2/33),两者之间差异具有显著性意义(P<0.05);EBV-IgA/VCA与LMP-1共表达的患者占NPC 患者总数的 62.5%(35/56).结论 NPC 患者外周血 EBV-IgA/VCA 表达与肿瘤组织中 LMP-1 阳性表达具有明显相关性;鼻咽癌发病与 EBV 感染明确相关.
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EB病毒潜伏膜蛋白1介导多重生物学效应的分子机制
EB病毒是一种与多种肿瘤发病相关的DNA致瘤病毒,其编码的潜伏膜蛋白1(LMP1),是一种具有转化活性的瘤蛋白.LMP1通过多条信号途经,介导细胞转化、细胞增殖、分化、细胞凋亡等多种生物学效应.
