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纯化和标记抗人轻链β2m的单克隆抗体在细胞表面HLA-Ⅰ类分子检测中的应用
HLA-Ⅰ类分子在单个核细胞(PBMC)表面表达丰富,HLA-Ⅰ类分子除了参与全身免疫应答外,还有调节免疫和参与免疫细胞分化的作用.研究表明,PBMC的HLA-Ⅰ类分子在细胞免疫中发挥着极为重要的作用,其表达降低可能会减弱机体对肿瘤细胞的杀伤力,从而导致肿瘤细胞逃避机体免疫监视[1].
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稳定表达人乳头瘤病毒16型E7癌基因HaCaT细胞系的建立及其研究
官颈癌是世界第二大妇女常见肿瘤[1].大量流行病学和分子生物学研究证实高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV),尤其是HPV16型在宫颈癌发生、发展进程中起关键作用[2-3].HPV16型E7基因编码蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关,在维持转化组织恶性表型的过程中发挥重要作用.本研究选择与官颈卜皮细胞相似的非肿瘤性人永生化表皮细胞(HaCaT)作为研究对象,通过真核表达载体pCMV将HPVl6 E7基因导人HaCaT细胞,使HPV16 E7在HaCaT细胞中表达,探讨其对HaCaT细胞的增殖、周期及HLA-Ⅰ类分子表达的影响.
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HLA-Ⅰ类分子与肿瘤逃逸
在肿瘤免疫应答过程中,MHC-Ⅰ类分子限制的C+8细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用,肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要涉及到MHC-抗原肽-TCR三原体结构的生成.
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002 HLA表型与肿瘤逃逸
HLA-Ⅰ类分子表达缺失是肿瘤细胞针对HLA分子具有向T细胞递呈免疫原性多肽这一作用而选择的一种逃逸机制.然而不同类型的肿瘤细胞或同一肿瘤在不同的发展阶段均呈现出不同的HLA-Ⅰ类表达类型.目前,肿瘤组织及肿瘤细胞系中HLA-Ⅰ类分子丢失的类型主要有4种:①HLA-Ⅰ类分子全部丢失;②HLA单倍型丢失;③HLA单个座位丢失;④HLA等位基因丢失.此外,在肿瘤发展过程中非经典HLA-Ⅰ类HLA-E、-G及MHC类似物的异常表达可以抑制NK细胞对肿瘤细胞的溶解,则反映了肿瘤细胞针对NK细胞的免疫监视作用而选择的一种逃避机制.每一个荷瘤病人都是一个独特的整体,都将产生一个特殊的有助于逃逸的变异体,因此,检测HLA抗原在肿瘤细胞上的表达是一个新的指标,有助于制定未来的肿瘤生物治疗策略.
关键词： HLA-Ⅰ类分子 HLA-E、HLA-G 肿瘤 -
NK细胞杀伤人骨髓瘤RPMI8226细胞的活性及其可能的机制
目的:研究同种异体NK细胞对人骨髓瘤RPMI 8226细胞的杀伤活性及其可能的机制.方法:LDH释放法检测NK细胞对RPMI 8226细胞和人白血病K562细胞的杀伤活性,流式细胞术和RT-PCR法分别检测K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体和HLA-I类分子的表达;阻断K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体的表达后,检测NK细胞的杀伤活性.结果:NK细胞对RPMI 8226靶细胞的杀伤活性明显低于对K562靶细胞的杀伤(P<0.01).K562细胞高表达NKG2D配体,不表达HLA-I类分子;RPMI 8226细胞低表达NKG2D配体,高表达HLA-I类分子,其HLA基因型为A 01,66;B 58,58;Cw 03,06.阻断NKG2D配体后NK细胞杀伤K562细胞的活性明显降低(P<0.01),而杀伤RPMI 8226细胞的活性无明显改变;阻断HLA-I类分子,NK细胞杀伤K562细胞的活性无变化,而杀伤RPMI 8226细胞的活性明显提高(P<0.01).结论:NK细胞杀伤RPMI 8226细胞的活性较低,其机制与RPMI 8226细胞高表达HLA-I类分子、低表达NKG2D配体有关.
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胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类分子表达降低的机制研究
目的:探讨胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类抗原表达水平异常的分子机制.方法:以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照,利用流式细胞仪检测细胞表面HLA-Ⅰ类复合物的表达情况,Western blot检测HLA-Ⅰ类分子重链及轻链表达情况,半定量RT-PCR检测HLA-Ⅰ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况,并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性.结果:胃癌细胞系MKN表面HLA-Ⅰ类复合物表达降低,重链A及B/C位点蛋白无表达而轻链表达无异常.在mRNA水平,胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失.微卫星DNA扩增结果初步显示,MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失.结论:胃癌细胞系MKN HLA-Ⅰ类分子复合物表达降低可能是由HLA-Ⅰ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的.
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人结直肠癌细胞表面HLA-Ⅰ类抗原下调与抗原加工递呈相关基因TAP1、TAP2、LMP2、LMP7表达关系的研究
目的 研究结直肠癌肿瘤细胞HLA-Ⅰ类分子与抗原加工递呈相关基因的表达关系,探讨结直肠癌肿瘤细胞HLA-Ⅰ类分子的表达下调机制.方法 通过免疫组化检测74例不同Dukes分期直肠癌细胞HLA-Ⅰ类分子,以RT-PCR技术检测其中35份相应标本TAP1、TAP2、LMP2、LMP7基因的表达.结果 结直肠癌细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达异常相当普遍,Ⅰ类分子阳性表达率为41.9%(31/74);随Dukes分期进展,Ⅰ类分子阳性表达率逐渐降低,A期73.6%(14/19)、B期53.6%(15/28)、C期25.0%(4/16)、D期18.2%(2/11),转移组24.0%(6/25)比未转移组57.1%(16/28)显著降低;表达Ⅰ类分子的肿瘤细胞TAP1、TAP2、LMP2、LMP7基本正常,未表达Ⅰ类分子的肿瘤细胞至少有一种基因异常,其中TAP1与Ⅰ类分子表达缺陷的关系更为密切.结论 结直肠癌HLA-Ⅰ类分子表达异常,其异常表达与TAP1、TAP2、LMP2、LMP7等Ⅰ类抗原加工递呈基因异常有关.
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HLA-Ⅰ类分子在黑素瘤中的表达
目的:检测HLA-Ⅰ(人类白细胞抗原-1)类分子在黑素瘤组织中的表达.方法:应用免疫组织化学方法检测77例黑素瘤组织中HLA-Ⅰ类分子的表达,并对蛋白的表达进行半定量分析,以20例色素痣组织做对照.结果:在77例黑素瘤组织中,HLA-Ⅰ类分子的阳性表达率为64％,而在色素痣组织中100％阳性表达.结论:在黑素瘤组织中HLA-Ⅰ类分子的表达下降,可能与人黑素瘤细胞的免疫逃逸有关.
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吲哚胺2,3-双加氧酶下调HLA-Ⅰ类分子的表达
目的:探讨人类吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)对细胞表面HLA-Ⅰ类分子的影响.方法:用脂质体法将含IDO基因的重组质粒pEGFP-IDO转染293T细胞,用Western blot检测IDOGFP在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-Ⅰ类分子的表达.结果:Western blot证实转染重组质粒的细胞表达IDO.转染空载体的细胞与转染重组质粒的细胞HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为299.46±62.65及42.51±8.19,两者相比有显著性差异(P＜0.01);转染重组质粒的细胞,未加色氨酸组与色氨酸组HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为309.17±34.89及692.12±33.42,两者相比亦有显著性差异(P＜0.01).结论:IDO下调细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达,色氨酸能够逆转IDO所致的HLA-Ⅰ类分子的下调.
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Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步探讨
目的 探讨人B细胞淋巴瘤Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的机制.方法 以K562细胞作为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤Raji细胞的活性.并分别用PCR方法和流式细胞仪检测K562和Raji细胞MICA/B、ULBP1-3、HLA基因型和分子的表达情况.效靶比20∶1时用单抗分别阻断K562和Raji细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ类分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化.结果 不同效靶比时NK细胞杀伤Raji细胞的活性明显低于杀伤K562细胞的活性,二者之间差异有统计学意义(P<0.05).K562细胞表达MICMB和ULBP1～3基因和分子,不表达HLA-Ⅰ类分子,Raji细胞表达ULBP1～3基因和HLA-Ⅰ类分子,不表达MICA/B和ULBP1～3分子.Raji细胞HLA基因型为A*3、3.B*71、71,Cw3、4.用单抗封闭MICMB和ULBP1～3分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对Raji细胞的杀伤活性无明显改变.结论 Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制和Raji细胞高表达HLA-Ⅰ类分子,不表达NKG2D的配体MI-CA/B和ULBPI～3有关.
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强的松对小儿原发性肾病综合症患者PBMC HLA表达的调节作用
目的: 初步探讨糖皮质激素对外周血单个核细胞(PBMC)人类白细胞抗原(HLA)表达的调控作用.方法: 肾病综合征(NS)患儿PBMC体外经IFN-γ联合PHA 刺激诱导活化,用不同浓度强的松干预,采用流式细胞术检测其PBMC组成性、活化后和强的松处理后HLA-Ⅰ/Ⅱ类分子和HLA-DR7分子的表达量并与正常对照组进行分析比较.结果: (1)体外培养NS患儿及正常人PBMC组成性表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子和HLA-DR7分子,且NS患儿高于正常人(尤以HLA-Ⅱ类分子突出,为正常人的11.78倍,P＜0.01);(2)体外经 IFN-γ联合PHA活化后HLA-Ⅰ/类分子和DR7分子表达增加(P＜0.01);(3)经不同浓度强的松处理后,HLA-Ⅰ/类分子和DR7分子比活化后表达减少(P＜0.01);(4)经不同浓度强的松预处理后,与活化组比较HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子和HLA-DR7表达减少(P＜0.01),对NS患儿的抑制率要高于正常人,并且HLA-Ⅱ类分子表达的抑制作用表现出剂量依赖性(P＜0.01).结论: NS患儿体内存在异常活化的T细胞;糖皮质激素对IFN-γ诱导活化的PBMC HLA表达有抑制作用.
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存活素及人类白细胞抗原Ⅰ类分子在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义
目的 探讨凋亡抑制因子survivin和HLA-Ⅰ类分子在人肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其临床意义.方法 应用免疫组化方法检测90例ccRCC组织与10例正常肾组织中survivin及HLA-Ⅰ类分子的表达.结果 10例正常肾组织均未见survivin表达,而HLA-Ⅰ类分子阳性率为100％.survivin阳性表达及HLA-Ⅰ类分子下调在90例ccRCC组织标本中表达分别为74例(82.2％)和61例(67.8％).survivin的表达率与肿瘤分级及淋巴结转移相关,而HLA-Ⅰ类分子的表达下调与患者年龄、性别、肿瘤分级、分期及淋巴结转移均无关.ccRCC组织中survivin表达与HLA-Ⅰ类分子的表达无相关性.结论 survivin、HLA-Ⅰ类分子异常表达参与了ccRCC的发生、发展过程,可能成为ccRCC的一个重要预后指标和治疗靶点.
