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  • 液-质联用分析肝癌细胞HLA-A2类分子递呈的抗原肽

    作者:隋延仿;郭爱林;叶菁;曲萍;张晓楠;张立红

    目的寻找MHCⅠ类分子递呈的、T淋巴细胞识别的肝癌抗原肽. 方法人肝癌细胞系hHCC以枸橼酸-磷酸盐(pH3.3)液洗脱,洗脱物经粗分离,得到相对分子质量(Mr)<5?000的各种多肽组分混合液;取各组分多肽分离液分别与抗原加工缺陷细胞(T2,HLA-A2)进行细胞表位重建,加入特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),51Cr释放法测杀伤活性;选活性值高的抗原肽组分进行反相高效液相色谱-质谱(RP-HPLC-MS)检测,对活性峰手工读谱分析其一级结构;后进行氨基酸同源性分析. 结果酸洗1010hHCC细胞,样品蛋白质浓度2mg/ml;通过RP-HPLC-MS检测,其质谱图经手工解析,氨基酸序列为SXXVHXNEV,X=1或L;氨基酸同源性分析证明SXXVHXNEV为SLIVHLNEV,是肝细胞生长因子受体的第1?075~1?083肽段,第1?080位点发生突变,由F变为L,由HLA-A2分子递呈. 结论细胞膜温和酸洗技术结合RP-HPLC-MS联用技术,是寻找肝癌抗原肽的有效方法,尚未见相同研究报道.发现的肝癌抗原肽SLIVHLNEV是肝细胞生长因子受体的突变物,可能具有重要生物学意义.

  • 慢性HBV感染者调节性T细胞、黏附细胞对细胞毒T淋巴细胞体外增殖的影响

    作者:李雪芬;葛霞琴;马兆文;汪金金;陈瑜

    乙型肝炎患者体内细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的功能和数量直接影响着病毒的清除和肝细胞的损伤.本实验主要探讨慢性HBV感染者调节性T细胞(Tr)、黏附细胞(AC)对HLA-A2限制的HBV特异性CTL体外增殖的影响.

  • 丙型肝炎病毒CTL表位的HLA-A2限制性及其免疫学效应研究

    作者:段志良;张丽芳;张琴;李文姝;朱珊丽;陈俊;夏克栋;文金生

    目的 研究前期鉴定的5条丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位的HLA-A2限制性及其免疫学效应.方法 基于T2胞株,采用MHC-肽复合物稳定性试验研究前期鉴定的HCV特异性CTL表位与HLA-A2分子的亲和力;采用细胞内细胞因子染色(intracellular cy-tokine staining,ICS)和ELISPOT研究七述HLA-A2限制性CTL表位体外刺激HLA-A2刚性外周血单个核细胞(PBMC)产生肽特异性CTL的效应;采用CTL杀伤试验研究上述肽特异性CTL杀伤靶细胞(负载相同肽的T2细胞)的效应.结果 前期研究鉴定的5条CTL表位肽中,NS4b_78(SMMAF-SAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)与HLA-A2分子有高亲和力(FI1);ELISPOT结果显示NS4b_78(SMMAFSAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)可诱导高水平的分泌IFN-γ的效应细胞[分别为(60±6)SFC/10~4PBMC vs(4±1)SFC/10~4PBMC,P<0.001;(10±3)SFC/10~4PBMC vs(2±1)SFC/10~4PBMC,P<0.001];ICS结果证实这两条肽刺激HLA-A2阳性PBMC后,在CD8~+T细胞中产生了高百分比的CD8~+IFN-γ~+T[分别为(2.33±0.22)%vs(0.05±0.01)%,P<0.001;(0.36±0.06)%vs(0.03±0.01)%,P<0.001];并且,肽特异性CTL可特异性杀伤负载相同肽的T2细胞.结论 NS4b_78(SMMAFSAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)受HIA-A2限制,并具有较好的免疫原性.

  • HLA-Ⅰ类分子与肿瘤逃逸

    作者:李文广;姚庆祥;畅继武

    在肿瘤免疫应答过程中,MHC-Ⅰ类分子限制的C+8细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用,肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要涉及到MHC-抗原肽-TCR三原体结构的生成.

  • 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤的识别与治疗

    作者:苏广梅;杨淑兰

    目的 预测人乳头瘤病毒(HPV)16型E6 E7癌蛋白的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法 采用超基序法与量化基序方案相结合的办法,对目的 蛋白HPV-16E6 E7的HLA-A2限制性CTL表位进行预测.结果 E6、E7各发现3个HLA-A2限制性CTL表位.结论 超基序法与量化基序方案联合应用可以提高预测效率.

  • 可生物素化HLA-A2-生物素化序列融合基因的构建与表达

    作者:钱丽;钱书兵;钱关祥

    本文采用RT-PCR技术从人外周血PBMC中克隆HLA-A2基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列后,装入pET-42b(+)高效表达载体进行诱导表达.并对表达产物进行纯化与复性.结果成功地扩增出HLA-A2基因并测序证实;构建了融合表达载体pET-HLA-A2,并获表达与纯化.为研究在原核系统中表达、纯化与复性及进一步体外构建MHC-I类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础.

  • 河南省肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者 HLA-A2的分布

    作者:王海楠;祁元明;高艳锋;周哲骏;李志勤;杜军波;李建斌;张毅

    目的:分析河南地区肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者HLA-A2的分布频率。方法:应用流式细胞术和聚合酶链反应/序列特异性引物( PCR-SSP)技术检测分析了72例健康人(正常对照)和438例肿瘤患者、110例慢性丙型肝炎患者、97例白癜风患者外周血中HLA-A2抗原的分布频率。结果:肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者中HLA-A2抗原的分布频率分别为49.1%、39.0%、47.4%,与正常对照组的48.6%比较,差异均无统计学意义(χ2=0.006,1.611,0.230,P均>0.05)。病例数超过50的肺癌(91例)、胃癌(56例)和食管癌(126例)患者中HLA-A2分布频率分别为42.9%、57.1%和38.0%,与正常对照比较,差异亦无统计学意义(χ2=0.537,0.919,2.081,P均>0.05)。结论:河南肿瘤、慢性丙型肝炎及白癜风患者HLA-A2的分布无特异性,因此HLA-A2限制性的生物细胞免疫治疗具有广泛的应用价值。

  • HLA-A2限制性人食管癌相关抗原COX-2表位的鉴定和改造

    作者:QI Feng;高艳锋;SUN Zhan-qiang;胡红敏;CHEN Li-xiang;祁元明

    目的 筛选和鉴定食管癌广泛高表达蛋白COX-2的HIA-A2限制性CTL表位.方法 运用生物信息学的方法 .以SYFPEITHI法初步预测.结合MHCPred 2.0和NetChop3.0 Server在线分析,设计出五条新的抗原肽.通过标准Fmoc固相合成法合成抗原肽,以流式细胞仪对其与HLA-A2分子的结合力和稳定性进行分析,并时结合力较低的P66(FI<0.5)的原始序列进行改造,将其序列第一位的苯丙氨酸替换成酪氨酸(P66Y1),以MTT实验检测抗原肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用.结果 P321对HLA-A2分子有较高的结合力(FI=1.93),同时P66Y1与HLA-A2分子的结合力显著增强(FI=1.48),并且它们与HLA-A2分子的稳定性较好(DC50>2 h).P321和P66Y1对表达COX-2的EC-9706、EC-1的杀伤率分别明显高于P66.结论 源于食管癌广泛高表达抗原COX-2的抗原肽P321和P66Y1能分别有效激发HLA-A2限制性CTL的免疫应答并杀伤肿瘤细胞.

    关键词: COX-2 抗原肽 HLA-A2 表位
  • 同种CTL识别表位的抗原肽非依赖性现象

    作者:蔡蕾;翁秀芳;梁智辉;吴雄文

    目的 初步探讨细胞毒T细胞(CTL)对同种抗原的识别机制.方法 用负载特定肽的T2细胞与HLA-A2阴性个体的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)共培养,激活同种反应性CTL,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法观察同种反应性CTL对不同载肽T2细胞的杀伤活性.结果 用负载特定抗原肽的T2细胞诱导所获得的同种反应性CTL对负载不同抗原肽的T2细胞及空载T2细胞具有同等杀伤效应.结论 同种反应性CTL对同种MHC分子的识别不依赖抗原肽.

  • 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤的识别与治疗

    作者:苏广梅

    目的 预测人乳头瘤病毒(HPV)16型E6 E7癌蛋白的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法 采用超基序法与量化基序方案相结合的办法,对目的 蛋白HPV-16E6 E7的HLA-A2限制性CTL表位进行预测.结果 E6、E7各发现3个HLA-A2限制性CTL表位.结论 超基序法与量化基序方案联合应用可以提高预测效率.

  • MART-1 HLA-A2限制性CTL表位的预测

    作者:王莉;吴玉章

    目的预测黑色素瘤分化抗原MART-1的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法采用超基序与量化基序多项式方案相结合的办法,对目的抗原MART-1的HLA-A2限制性CTL表位进行预测.结果预测出了6个九肽表位.结论两种方法预测结果的一致性较好,所预测出的6个MART-1的HLA-A2限制性CTL表位经后续实验筛选、鉴定后,可望用于新型MART-1肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究,为临床特异性治疗恶性黑色素瘤奠定基础.

  • 人食管癌TE-1细胞MHC-Ⅰ相关抗原肽的初步研究

    作者:李纪明;祁元明;杨莹;常爱武;王桂叶

    目的寻找TE-1细胞MHC-Ⅰ类分子提呈的抗原肽.方法用弱酸洗涤法获得TE-1细胞表面与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽,经SepPak-C18柱、Centrion-3超滤器和RP-HPLC去盐纯化后,用负载该抗原肽的树突状细胞刺激生成肿瘤特异性杀伤细胞,以Cr51释放法测定CTL的杀伤活性.结果高效液相色谱图显示多个峰;负载抗原肽DC刺激的CTL比未负载抗原肽DC刺激的CTL对TE-1细胞杀伤率高,两者差异有统计学意义;负载抗原肽DC刺激的CTL对与抗原肽孵育的T2细胞比对未经与抗原肽孵育的T2细胞杀伤率高,两者差异有统计学意义.结论弱酸洗涤法可从TE-1细胞上获得有效的抗原肽;混合抗原肽中有可与HLA-A2分子结合并能激发CTL的抗原肽.

  • mPEG-BTC对淋巴细胞表面HLA-A2抗原化学修饰效果评价

    作者:张印则;李伟;周华友;兰炯采;章扬培;张志新

    目的研究mPEG-BTC有效修饰淋巴细胞表面HLA-A2抗原、阻断其与相应抗体间特异性结合的方法.方法在室温下、pH 7.4的磷酸盐溶液中,采用浓度梯度法修饰淋巴细胞表面HLA-A2抗原,用微量淋巴细胞毒试验检测其修饰效果.结果经mPEG-BTC处理后的淋巴细胞微量淋巴细胞毒试验为阴性.结论在本实验条件中,mPEG-BTC对淋巴细胞表面HLA-A2抗原具有良好的化学修饰作用,可以完全阻断其与HLA-A2抗体的反应.

  • HLA-A2相关肝癌抗原肽的初步研究

    作者:郭爱林;隋延仿;叶菁;曲萍;张晓楠;张延凤;李增山

    目的寻找肝癌细胞表达的肿瘤抗原肽.方法应用0.2mol/Lph3.0柠檬酸缓冲液酸洗肝癌细胞系HHCC,经Sephadex G-25过滤及反向高效液相色谱分离纯化,获得可与HLA-Ⅰ类分子结合的不同组分短肽.将其与抗原加工缺陷的HLA-A2+T2细胞反应,进行肿瘤细胞特异性表位测定,同时进行CTL杀伤鉴定.结果获得4个可与HLA-A2结合的组分,其中2个可以激发较强的CTL杀伤反应.结论肝癌细胞系HHCC中存在能够激发CTL特异性反应的肿瘤抗原肽,并证实上述寻找肿瘤抗原肽的技术路线具有可行性.

  • 树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究

    作者:张秀敏;郭风;林慧;曲萍

    目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC) 负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL 的能力及其抗肿瘤效应.方法:MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr 释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验.结果:用DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用.结论:DC负载抗原肽QLVFGIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应.

  • 反义HLA-A2 cDNA抑制人成纤维细胞于大鼠脑内移植后的免疫排斥反应

    作者:李颖;杨慧;徐群渊;姬曼;张耀芬;段德义

    为了探讨人类白细胞抗原(HLA)反义RNA在抑制异种移植免疫排斥反应中的作用,用HLA-A2反义cDNA和GDNF共表达的逆转录病毒转导人胚肺成纤维细胞,再移植到Parkinson病大鼠模型纹状体(实验组);同时移植到未感染病毒的人成纤维细胞作对照.移植后每周检测大鼠旋转行为的变化;并于4 d、2周、6周灌杀大鼠,进行HLA-A、CD4、CD8以及人核糖核蛋白颗粒(RNP)免疫组化染色等以观察宿主的免疫排斥反应和移植物在脑内的存活情况.结果发现:两组间动物的旋转行为变化不明显.实验组HLA-A阳性细胞数在移植后的各时间点均明显少于对照组(P<0.05).移植后4 d两组的CD4和CD8阳性细胞数量变化均不明显(P>0.05),CD8细胞较多.2周和6周时实验组的CD4阳性细胞均明显少于对照组(P<0.01),且随时间逐渐下降.2周后实验组的CD8细胞基本消失,而对照组的CD8水平在2周时仍较高,6周时也可见到.实验组RNP阳性细胞数量在各个时间点都明显多于对照组(P<0.01),到6周时明显下降,12周时完全消失.反义HLA-A2 cDNA可以降低异种移植引起的免疫排斥反应程度,延长移植物存活时间,但抑制长期免疫排斥反应方面仍需寻找更好的方法.

  • 加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

    作者:张彩娥;邓云华;吴雄文;梁智辉;翁秀芳;卢小玲;夏芳珍;钟茂华;陆盛军

    目的 制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体.方法 以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体.利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Western blot和ELISA鉴定折叠产物的构象.以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体.结果 该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性.结论 成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体.

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