甲醇酵母Pichia pastoris高表达人神经生长因子的检测及意义

神经生长因子(NGF)可促进神经元存活、生长发育与分化,对早老性痴呆[1]、帕金森病[2]和外周神经疾病[3]等的治疗有重要作用.本研究应用Pichia pastoris酵母对扩增出的人β-NGF基因进行蛋白表达并进行免疫活性分析.

人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病的疗效和安全性

目的:考察人神经生长因子(hNGF)对糖尿病性多发性神经病(DPN)的疗效和安全性.方法:采用随机双盲对照研究,60例DPN患者分hNGF治疗组30例,给予hNGF 4mL·d-1(1 000U)肌内注射,对照组30例给予安慰剂4mL肌内注射,2组疗程均为12周.主要观察指标为神经体征(密西根糖尿病神经评分,MDNS),辅助观察指标为神经症状(自觉感觉异常)和神经传导速度(NCV).结果:治疗84d后2组中度和重度患者的MDNS评分显效率比较差异均有显著性(P<0.05),治疗后84d和168d,治疗组NCV异常率均显著低于对照组(44.00% vs 72.67%,P<0.01;39.23% vs 62.86%,P<0.01).治疗组疗效确切,未发现严重不良反应.结论:hNGF治疗DPN安全有效,其疗效和NCV的改善与hNGF治疗开始时间、疗程长短、DPN病变的程度密切相关.

单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制

目的 制备抗人神经生长因子(hNGF)单克隆抗体,并开发一种检测hNGF含量的ELISA试剂盒.方法 以重组入神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗hNGF的单克隆抗体,然后建立快速检测hNGF含量的ELISA检测试剂盒.结果 获得1株可分泌抗hNGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株.建立1种检测hNGF含量的ELISA试剂盒,该检测方法的回收率为85％～105％,灵敏度为0.63 ng/ml,变异系数＜10％,且特异性良好.结论 成功制备了抗hNGF的单克隆抗体,并建立了一种可快速检测hNGF含量的ELISA试剂盒.

利用一种新的DNA操作系统克隆人神经生长因子△(简报)

神经生长因子(NGF)是早发现的神经趋化因子.它对神经细胞具有营养与保护作用,对损伤神经具有调节与修复功能.为大量获得重组人NGF,本研究采用构建杂合克隆因子(hybrid clonemid)进行DNA操作,使NGF基因与pET-16 b载体重组. 根据人NGF基因序列合成一对PCR引物,并在引物的5'端加上与载体互补的一小段序列(21bp).

人神经生长因子在昆虫细胞中的表达

神经生长因子(NGF)在外周及中枢神经系统的发育及存活方面起着重要的作用.它可以促进外周感觉神经元及背根神经节神经元的增生.中枢神经系统中,NGF主要存在于前脑底部胆碱神经元中,其脑中含量的减少与Alzheimer病引起的记忆力减退及老年斑沉积呈正相关[1].因此NGF药用方面的作用已受到人们的重视,它可望成为治疗Alzheime病的新型药物.

人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性

目的在CHO细胞中共表达二氢叶酸还原酶(DHFR)基因及人神经生长因子β亚基(β-hNGF)基因,并对表达产物进行鉴定和生物活性分析.方法克隆DHFR和β-hNGF基因,测序,酶切,连接到真核表达载体pBudCE4.1中,构建人NGF基因重组表达质粒pBudCE4.1/DHFR/β-hNGF,经电转染法导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)中,经添加Zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+细胞克隆.经MTX加压筛选高表达β-hNGF的CHO细胞株.SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定,并利用鸡胚背根神经节法检测表达蛋白的生物活性.结果人神经生长因子在CHO细胞中得到较高表达,表达量达0.3μg/ml,且表达产物具有良好的生物活性.结论为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了基础.

人神经生长因子(NGF)的研究进展

近年来，随着生物学的发展，人们对神经生长因子的研究也日益成熟，它的临床应用得到了人们的广泛关注。本文着重对人神经生长因子的生物学作用、临床用途及国内外研究进展等几个方面加以介绍。

神经生长因子治疗糖尿病周围神经病的临床及电生理观察

目的:观察人神经生长因子(hNGF)对糖尿病性多发性神经病(DPN)的疗效及安全性.方法:对30例病人进行了治疗前后临床评价及正中神经、尺神经、腓总神经及腓肠神经运动、感觉传导速度和运动末端潜伏期测定.结果:hNGF可不同程度地减轻病人的肢体麻木、疼痛及发凉等临床症状;正中、尺、腓总神经传导速度也有明显的改善;治疗过程中未发现明显的不良反应.结论:人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病是安全有效的.

人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病的临床分析

目的:探究人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病的临床效果.方法:选取于2014年1月-2015年12月来笔者所在医院治疗的糖尿病性多发性神经病患者86例,随机分为甲乙两组,每组43例.甲组给予人神经生长因子治疗,乙组给予甲钴胺治疗,比较两组患者临床效果.结果:甲组患者治疗总有效率明显高于乙组,差异有统计学意义(P＜0.05),甲乙两组治疗后感觉神经传导速度及运动神经传导速度较治疗前都有明显改善,差异有统计学意义(P＜0.05),甲组患者改善情况优于乙组,差异有统计学意义(P＜0.05),两组患者临床症状均有明显改善,甲组改善效果优于乙组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:使用人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病,效果显著,值得临床推广.

APP11肽对糖尿病大鼠神经病变的治疗作用

重组人神经生长因子(rhNGF)治疗糖尿病外周神经病变(DPN)在西方国家已进入第三期临床试验,初步结果正如人们所期望的那样,rhNGF能特异性地改善小纤维外周神经元的功能[1].我们几年来的研究表明STZ糖尿病鼠不仅存在DPN,而且脑和脊髓神经元也存在明显的神经退行性病变.特别在海马神经元尤为明显.但这种神经退行性病变可被皮下注射APP(β-amyloid precursor protein)17肽(APP695中319～335肽段)而获明显改善[2-4].

人神经生长因子对糖尿病多发性神经病大鼠坐骨神经calpain Ⅱ的作用

目的:观察人神经生长因子(hNGF)对早期糖尿病多发性神经病(DPN)大鼠坐骨神经中calpainⅡ表达的影响.方法:用链佐星(STZ)一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型,在DPN 4周(造模后4周)腹腔注射hNGF 90 U/(kg·d),共4周.用原位杂交和免疫组化方法观察坐骨神经calpainⅡ mRNA和蛋白表达.结果:DPN 8周大鼠坐骨神经calpainⅡmRNA和蛋白表达明显减少.用hNGF治疗的DPN大鼠calpainⅡmRNA和蛋白表达增加.结论:hNGF治疗能纠正早期DPN大鼠坐骨神经calpainⅡmRNA和蛋白表达异常.

人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病的随机双盲研究

目的:观察人神经生长因子(hNGF)治疗糖尿病性多发性神经病(DPN)的有效性及安全性.方法:采用双盲随机对照研究,48例DPN病人随机分为2组:hNGF组24例,每日给予hNGF 4 mL(1 000 u),肌注:对照组24例,每日给予安慰剂4 mL,肌注,疗程均为12周.结果:hNGF组治疗12周后,患者MDNS和自觉感觉障碍有效率分别为73.83%和83.33%,明显高于安慰剂组.治疗结束后4及12周,其有效率仍显著高于对照组.治疗期间未发现严重不良反应.结论:hNGF治疗DPN有效且安全.

带有HIV Tat-蛋白转导域的人成熟神经生长因子的分泌表达及鉴定

HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)是一个公认的具有介导靶蛋白跨膜作用的肽段.为了表达出可溶的并具有生物学活性的PTD-NGF融合蛋白,作者首先根据人神经生长因子成熟肽(hNGFm)的基因序列设计引物,利用PCR技术直接从人胎盘的基因组DNA中扩增出hNGFm的编码序列,同时利用PCR引物在其5'和3'末端分别加上HlV-Tat-PTD及组氨酸标签(His-Tag)的序列,然后将PCR产物克隆于原核表达质粒pET22b中pelB leader的下游,构建分泌表达质粒pET22b-PTD-hNGFm-His.将该质粒转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测显示有两种表达产物,Mr分别为16 ku和18.4 ku,分别位于大肠杆菌周质腔和细胞质中,两者均可与抗hNGF抗体反应.周质腔表达产物(PTD-hNGFm-His)经Ni2+螯合亲和层析纯化后纯度达98%以上,纯化的PTD-hNGFm-His融合蛋白刺激神经突起生长的适浓度为20 ng/ml.因此成功构建了PTD-hNGFm-His分泌表达载体并在大肠杆菌中进行了分泌表达,得到了可溶且具有生物活性的PTD-hNG-Fm-His融合蛋白.

不同载体构建人神经生长因子的比较

探讨人神经生长因子(hNGF)在不同信号肽同一载体与不同载体表达量的差异.应用分子生物学技术从pcDNA3.1-β-NGF中获得β-NGF基因,并对它进行替换载体和优化信号肽,构建两个新重组质粒pMD902-β-NGF和pcDNA3.1-His-β-NGF,通过酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒构建成功;利用脂质体转染技术,将重组质粒pMD902-β-NGF、pcDNA3.1-β-NGF和pcDNA3.1-His-β-NGF转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中,通过ELISA技术,检测到CHO细胞上清中有NGF的表达,优化信号肽的pcDNA3.1-His-β-NGF表达量高于没有优化信号肽的pcDNA3.1-β-NGF.重组质粒pMD902-β-NGF表达量低.鸡胚背根神经节法检测,表达产物都能促进神经节的生长.通过实验分析发现,3个重组质粒表达水平有较大差异.

人神经生长因子注射液人体药物安全观察

各种因素造成的神经系统损伤疾病的患者数目庞大,尤其随着人口老年化程度的升高,老年性痴呆症、糖尿病性周围神经病患者日益增多,对这类疾病的治疗目前尚无有效药物.大量体内外实验表明,神经生长因子(Nerve Growht Factor,NGF)对神经损伤及许多退行性神经系统的疾病有明显疗效.[1]我们以人胎盘为原料,建立了人神经生长因子(HuNGF)纯化制备工艺.[2]药效学试验证明本药对神经损伤有治疗作用.[3]已完成临床前试验并获准进入临床研究.

人神经生长因子长期毒性试验的报告

神经生长因子(NGF)具有在发育过程中促进神经系统生长,对周围神经发挥营养作用;机体成熟后,可保护神经元,减少自然死亡的发生;在中枢神经系统中的NGF可增强基底前脑的胆碱能标志;神经损伤后,可增强神经元的存活和功能恢复,可促进受损神经纤维的再生和修复等生物学功能[1,2].本实验室从正常人胎盘绒毛中制备的NGF[3],通过动物实验结果表明,对神经系统有明显的促进作用[4].本研究用人神经生长因子(HuNGF)对大鼠进行长期毒性试验,观察连续给予HuNGF后是否由于积累对机体产生毒性反应及其严重程度,提供产生毒性反应的靶器官及其损害的可逆性,确定无毒副作用的剂量,为拟定安全的临床用药剂量,提供参考依据.现将结果报告如下:

王国华研制成功人神经生长因子口服胶囊

人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性.方法将NGFβ目的基因亚克隆人表达载体pBV220的BamHI-BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及PC12细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性.结果成功构建了重组质粒pBV220/NGFβ.使用该质粒转化DH5o宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS-PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中.通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的NGFβ.每升表达菌可以获得1.8～2.0 mg NGFβ.鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的NGFβ是具有生物活性的.它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105BU/g.结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白.