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甲氨蝶呤米非司酮用于宫外孕保守治疗对照研究
甲氨蝶呤是一种叶酸类抗代谢的抗肿瘤药物.通过抑制二氢叶酸还原酶,影响叶酸的生物学功能,从而阻断嘌呤和胸腺嘧啶的合成,使DNA和RNA的生成受到抑制,对恶性葡萄胎和绒毛膜上皮癌有显效[1],近年用于宫外孕的保守治疗,疗效明显,但有毒副作用,主要表现为粒细胞减少,胃肠反应明显.而米非司酮的应用为我们宫外孕的保守治疗提供了一种给药方便、副作用少、疗效确切的方法.
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内皮型一氧化氮合酶来源的一氧化氮通过 S-亚硝基化修饰二氢叶酸还原酶抑制其降解
内皮型一氧化氮合酶（eNOS）作为内皮细胞一氧化氮（NO）产生的主要来源，在多种心血管疾病中扮演重要角色。eNOS的功能受多种因子调控，其中四氢生物蝶呤（BH4）可通过维持 eNOS 偶联状态而促进其形成 NO，而非解偶联状态下生成超氧阴离子，进而保护内皮生理功能。二氢叶酸还原酶（DHFR）作为生成四氢生物蝶呤（BH4）的主要蛋白酶，对内皮功能调控具有重要影响，然而 eNOS 对 DHER 是否具有调控作用及相关机制尚不清楚。
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步，针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段（MSP1-17）的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组［1］。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因进行多态研究时，所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点，通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态［2］。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因（Pfmdr1）片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因，从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在［3］。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素，带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接［4］。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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白血病耐药相关细胞信号转导通路研究进展
白血病是恶性血液病，化疗在治疗中占据着不可替代的地位。化疗可以使多数患者获得缓解，甚至治愈，但终仍有大部分患者因耐药所致化疗失败而死亡。白血病耐药类型大致可分为内源性和获得性，前者是白血病治疗前就存在对某种或多种化疗药物无反应性，后者则是化疗诱导的耐药性［1］。根据耐药谱不同，又可分为单药耐药（ primary drug resistance ，PDR）和多药耐药（multidrug resistance，MDR）。 PDR只对单一药物耐药而对其他化疗药物仍保持敏感；MDR又称为多向性耐药（ pleiotropic drug resistance ），即对多种结构、功能及作用机制均不同的化疗药物产生交叉耐受。 MDR发生与多种因素有关，涉及白血病细胞的多药耐药基因（ MDR1）及其编码的糖蛋白（ P-gp）、多药耐药相关蛋白（ MRP1-6）、谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH ）、谷胱甘肽S转移酶（GST）、拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）、肺耐药蛋白（LRP）、热休克蛋白（ HSP）、金属硫蛋白（ MT）、O6烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（ O6 AGT）、胸苷酸合成酶（ TS）、二氢叶酸还原酶（ DHFR）等。白血病耐药的机制非常复杂，对抗白血病耐药的方法也很多，如采用联合用药改进化疗方案、应用耐药逆转药、免疫调节、基因治疗。肿瘤细胞表达耐药相关蛋白和产生耐药，受到信号转导通路调控，主要涉及丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、细胞凋亡相关蛋白、NF-κB家族蛋白、磷脂酰肌醇3激酶（ phosphatidy1inositol3-ki-nase，PI3K）、热休克蛋白、Ras蛋白等。
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人骨保护素在 CHO 细胞内初步稳定表达
目的：构建人OPG的稳定表达载体，并在DHFR-型CHO细胞内稳定表达。方法用RT-PCR的方法获得人全长OPG的编码基因，并将其克隆入载体pcDNA3.1-DHFR/CT-GFP，鉴定无误后，转染DHFR-型CHO细胞，经MTX筛选获得阳性表达OPG的细胞株。结果成功构建人OPG的稳定表达载体，并获得阳性表达OPG的细胞株。结论全长人OPG基因可以在CHO细胞内成功稳定表达，这为OPG的功能研究及临床应用奠定物质基础。
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二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响
目的 探讨二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达上调对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞顺铂耐药的影响.方法 构建携带DHFR基因的重组慢病毒载体(即重组载体DHFR-pWPI),利用脂质体lipofectamine 2000将其转染至卵巢癌细胞系SKOV3细胞中.实验分为3组:转染组(转染重组载体DHFR-pWPI质粒)、阴性对照组(转染慢病毒载体pWPI质粒)、空白对照组(未转染任何质粒).(1)蛋白印迹(western blot)法检测3组SKOV3细胞中DHFR蛋白的表达;(2)流式细胞仪检测3组SKOV3细胞经不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml)顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞凋亡率,以及经3组细胞各自的50％抑制浓度(IC50;分别为6.0、4.0、4.9μg/ml,下同)的顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞周期比例;(3)高效液相色谱法检测3组SKOV3细胞经不同浓度(4.0、6.0、8.0 μg/ml)顺铂作用不同时间(24、48 h)后其细胞内顺铂浓度的变化;(4)透射电镜观察3组SKOV3细胞经各自的IC50的顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后细胞超微结构的变化.结果 本研究成功构建携带DHFR基因的重组载体DHFR-pWPI并转染入SKOV3细胞.(1)western blot法检测显示,转染组细胞中DHFR蛋白表达水平为10.280±0.009,明显高于阴性对照组及空白对照组(分别为2.050±0.003、3.480±0.003;P＜0.01).(2)流式细胞仪检测显示,不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml)的顺铂作用24、48 h后,转染组细胞凋亡率均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);而顺铂浓度为5.0、10.0 μg/ml作用72 h后,转染组细胞凋亡率则明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h时,其细胞均以G0/G1期细胞为主,且转染组Go/G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);而作用72 h时,3组细胞均以G2/M、S期细胞为主,且转染组S期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01).(3)高效液相色谱法检测显示,顺铂浓度为4.0 μg/ml作用24、48 h后,以及顺铂浓度为6.0 μg/ml作用24 h后,转染组细胞内的顺铂浓度均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);而顺铂浓度为6.0 μg/ml作用48 h以及8.0 μg/ml的顺铂作用24、48 h后,转染组细胞内的顺铂浓度均明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).(4)透射电镜下观察,3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h后,转染组SKOV3细胞的微丝聚集,线粒体数量及结构改变明显,而空白对照组及阴性对照组细胞微丝少见,线粒体数量减少,但结构改变不明显;3组细胞均出现扩张的内质网,正常的细胞器少见.顺铂作用72 h后,转染组细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡;而空白对照组及阴性对照组细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量聚集,进入明显的坏死阶段.结论 本研究采用慢病毒载体系统成功构建了携带DHFR基因的重组慢病毒载体,DHFR基因表达上调后卵巢癌SKOV3细胞的耐药性增加,其耐药性增加可能与微丝的聚集及线粒体的改变有一定的联系.
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耐药相关基因二氢叶酸还原酶在人胰腺癌细胞株中的表达
目的 探讨耐药相关基因二氢叶酸还原酶(DHFR)在胰腺癌细胞株中的表达.方法 通过RT-PCR和Western-blot方法 分别测定六株人胰腺癌细胞(SW1990,Capan-1,AsPC-1,MiAPaCa-2,PANC-1,P3)中的DHFR在基因和蛋白水平上表达.结果 在六株人胰腺癌细胞株中,DHFR在基因水平上的表达各细胞株之间没有显著性差异(P＜0.05);DHFR蛋白的表达水平以AsPC-1和P3较高,与其余四株细胞之间均存在着显著性差异(P＜0.05),而SWl990、Capan-1、MiAPaCa-2、PANC-1之间及AsPC-1、P3之间则无显著性差异(P＞0.05).结论 结合本组先前研究结果 提示胰腺癌细胞株对DHFR抑制剂的低敏感性与DHFR蛋白的高水平表达有关,DHFR参与了胰腺癌对化疗的耐药.
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二氢叶酸还原酶启动子甲基化与脑梗死的相关性研究
目的 探究叶酸代谢通路中二氢叶酸还原酶(DHFR)基因启动子区DNA甲基化与脑梗死发病的相关性.方法 选取解放军148医院2017年9月至2018年6月住院患者,采用病例对照方法,确诊脑梗死患者152例设为病例组,健康受试者152例为对照组,提取基因组DNA,以亚硫酸氢盐修饰后使用荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)测定引物区CG位点甲基化程度,并以甲基化参考百分比(PMR)描述甲基化水平.结果 病例组患者DHFR基因甲基化程度显著低于对照组(z=3.219,P=0.001),进一步分析提示,主要在男性亚组中表现得更为显著(z=3.716,P<0.001);Logistic回归分析发现,DHFR甲基化是脑梗死的一个保护因素[OR(95％CI)=0.988(0.979-0.998),P=0.015].此外,病例组患者的甲基化水平与年龄呈正相关(r=0.301,P<0.001).结论 外周血DHFR启动子区低甲基化与脑梗死相关,其甲基化水平升高是脑梗死的一个保护因素,有可能成为脑梗死的潜在生物标志物.
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多芳基取代蝶啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性
目的研究多芳基取代蝶啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性.方法由4,6-二氨基-5-亚硝基嘧啶衍生物与对-氨基苯乙腈衍生物通过环化合成目的物;采用MTF法测定目的物的抗肿瘤活性.结果设计、合成了9个新化合物(Ⅰ～Ⅲ),其结构经元素分析、IR,HNMR和MS等确定.化合物Ⅰ～Ⅲ的体外抗肿瘤活性较明显.结论化合物Ⅰ～Ⅲ显示了一定的体外抗肿瘤活性,但它们与小牛胸腺DNA之间并无明显作用,提示可能是通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)或其他叶酸依赖性酶而起抗肿瘤作用.
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胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶双抑制剂的研究进展
胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶在肿瘤、病菌的化学治疗中都是重要靶点,已有多种抑制剂应用于临床.近年来,随着对胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶作用机制和抑制剂的耐药机制的不断阐明,人们设计和合成了一系列新的抑制剂,其中胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶双抑制剂成为研究的热点之一.文中对胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶抑制剂药物临床应用进行综述,并介绍胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶双抑制剂的研究进展.
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抗叶酸剂类抗肿瘤药物的研究进展
抗叶酸剂通过抑制叶酸依赖性酶的生物活性,阻断核酸和某些氨基酸的生物合成,导致肿瘤细胞的死亡,在临床上用作抗肿瘤药物.现综述近年来以叶酸依赖性酶,如胸苷酸合酶和二氢叶酸还原酶为靶酶的抑制剂的分子设计及生物活性,同时还简要介绍了胸苷酸合酶和二氢叶酸还原酶双抑制剂的研究进展.
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甲氨喋呤的不良反应
1药理作用甲氨喋呤(MTX),为叶酸类似物,单独或联合治疗用于白血病和实体瘤,如乳腺癌、头颈部癌、小细胞肺癌、膀胱癌等.该药是二氢叶酸还原酶(DHFR)的特异性抑制剂,而DHFR在细胞叶酸代谢中起关键作用,从而使用细胞阻断在S期,导致嘌呤及胸腺嘧啶核苷酸合成的障碍,使DNA、RNA及蛋白质合成感受到抑制[1].
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甲氨蝶呤的不良反应和防护措施
甲氨蝶呤是常用的抗代谢类抗肿瘤药,系叶酸拮抗剂,能抑制二氢叶酸还原酶,干扰DNA的合成,从而使肿瘤细胞增生受抑制,用于急性白血病,尤其是急性淋巴性白血病、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等效果较好.对头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌及盆腔肿瘤也有一定疗效.采用动脉插管滴注,对头颈部癌也有较好的疗效.其副作用有骨髓抑制,主要表现为白细胞和血小板减少,严重时可有全血抑制,胃肠道反应除常见的恶心、呕吐及食欲减退外,还有口腔粘膜炎症和腹泻,严重时可出现肛门、直肠粘膜炎及出血性溃疡,应减量或停药.此外还可引起皮疹、皮炎、脱发等.大剂量或长期应用,可使肝肾功能损伤,应慎用.用药时期间严格检查血象.本文主要对患儿出现不良反应的防护措施简介如下.
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急性白血病甲氨蝶呤耐药及化疗个体化初探
研究表明,还原性叶酸载体(RFC)功能、甲氨蝶呤多聚谷氨酸(MTXPG)水平及二氢叶酸还原酶(DHFR)活性是影响甲氨蝶呤(MTX)疗效的三大主要原因[1].我们通过研究白血病患者原代细胞MTX耐药、个体差异机制,以期为MTX临床个体化、合理用药提供一点线索.
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大剂量甲氨蝶呤治疗小儿急性淋巴细胞白血病的护理研究
急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种进行性恶性疾病,在小儿恶性肿瘤中发病率占首位,近年来由于受环境影响,发病呈上升趋势.化疗可取得满意的效果,但发生髓外白血病将影响患儿长期生存.甲氨蝶呤通过对二氢叶酸还原酶的抑制,使叶酸不能转变为具有生理活性的四氢叶酸酶而发挥辅酶作用.并且大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)可通过血脑、血睾屏障,起到预防髓外白血病的作用,从而提高长期生存率[1].
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大剂量甲氨喋呤化疗致口腔黏膜炎的观察与护理
口腔黏膜炎(oral mucositis,OM)是指口腔的炎症性和溃疡性反映,是恶性肿瘤患者化疗后常见的并发症之一.甲氨喋呤(MTX)为抗叶酸类抗肿瘤药,属抗代谢药类,主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞的合成,从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖.大剂量甲氨蝶呤治疗多用于急性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤及乳腺癌、卵巢癌等疾病.其疗效虽然显著,但其副作用较大,常可导致严重的消化道黏膜溃疡、发热及出血等,其中口腔黏膜并发症发生率较高[1],尤其在骨髓抑制期黏膜的损伤增加了感染,特别是致死性感染的几率,同时给患者带来了巨大痛苦.因此,化疗后患者口腔溃疡的治疗和护理尤为重要,对保证化疗计划顺利执行及提高生活质量有重要的意义.2008年3月～2011年5月,我科收治79例应用大剂量甲氨蝶呤治疗导致不同程度的口腔炎患者,现将护理体会报道如下.
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晚期非小细胞肺癌中循环RNA检测对培美曲塞治疗疗效的研究
目的:探讨培美曲塞治疗晚期非小细胞肺癌NSCLC的疗效及预后因子.方法:回顾性分析2016年7月-2018年6月在南通市肿瘤医院接受培美曲塞联合顺铂一线化疗的100例ⅢB期、Ⅳ期NSCLC患者.采用荧光定量PCR方法检测患者外周血TS、DHFR基因表达情况,研究各项指标与NSCLC治疗疗效的关系.同时选取98例健康体检者的外周血样本作对照.结果:100例NSCLC患者接受培美曲塞单药或联合治疗,无CR病例,PR 25例,SD 45例,PD 30例.25例化疗敏感者的DHFR水平为(0.21±0.11)pmol/L,75例化疗抵抗者的DHFR水平为(0.41±0.18) pmol/L,组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:外周血TS可作为预测培美曲塞化疗晚期肺癌预后的分子标志,DHFR可能作为近期疗效的预测因子.
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虫库FCC1/HN恶性疟原虫分离株某些生物活性鉴定
为了便于进( )保护性观察及建立恶性疟原虫克隆株的需要,对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株进行某些生物特性鉴定.通过体外培养条件变更以观察现存FCC1/HN分离株恶性疟原虫的生长特征,以体外微量法测定该株原虫对氯喹的敏感性及用套式PCR/RFLP分析方法对该株原虫二氢叶酸还原酶基因型进行鉴定.结果显示,现存FCC1/HN株恶性疟原虫对体外培养条件适应性强,对氯喹高度敏感,DHFR基因的第108号编码为AAC突变型.建议对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/IN分离株的生物活性定期进行鉴定.
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叶酸和维生素B12与细胞巨幼变的病理生理
1 叶酸的代谢与细胞巨幼变叶酸又称蝶酰谷氨酸,由蝶酸和谷氨酸(α氨基戊二酸)结合而成.而蝶酸又是由2-氨基4羟基6-甲基蝶呤啶和对氨基苯甲酸所构成,2-氨基4-羟基6-甲基蝶呤啶中的5,6,7,8位可以受氢,受氢反应是在二氢叶酸还原酶和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)参与下成为具有活性的四氢叶酸(tetrahydrofolic,FH4).
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大剂量静脉滴注甲氨蝶呤的不良反应及防护措施
甲氮蝶呤(MIX)是常用的抗代谢类抗肿瘤药，系叶酸拮抗剂，能抑制二氢叶酸还原酶，干扰DNA的合成，从而使肿瘤细胞增生受抑制。主要用于治疗急性白血病及恶性淋巴瘤，尤其是对急性淋巴细胞白血病效果较好，但也有一些副作用。本文……
