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TA克隆的快速鉴定
TA克隆技术原理是Taq酶参与的PCR反应中,产物双链核酸中的3′端各多连接一个脱氧腺嘌呤核苷酸(A),与商业开发的5′端各多一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)的质粒载体,在DNA连接酶作用下,按碱基配对形成环状的完整质粒,转化细菌,质粒扩增形成克隆.由于存在载体自连的现象,TA克隆的鉴定十分必要,本文利用快速质粒提取和载体中现有的成对限制性内切酶位点,使TA克隆技术更方便实用.
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下,于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步,针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用,PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了,从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介,再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分,直接关系到PCR的敏感性和特异性,通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加,引物的职能也在不断增加,除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外,还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段(MSP1-17)的PCR扩增,其引物设计时,在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码,反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码,由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组[1]。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如,对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR)基因进行多态研究时,所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点,通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态[2]。又如,为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)片段的多态性,使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列,带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因,从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在[3]。另外,在PCR引物末端带上某种配体,以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结,如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素,带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接[4]。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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应用分子生物学方法对黑线姬鼠体内恙虫病东方体基因型分析
从野外优势鼠种黑线姬鼠分离到的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)与恙虫病人Ot分离株血清型别相同.为进一步从分子水平了解黑线姬鼠的宿主作用,采用Nested-PCR结合限制性内切酶片段长度多态分析(RFLP)技术对Ot-Sta56基因型进行分析.
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2',5'寡腺苷酸合成酶及其在病毒性肝炎中的临床意义
2',5'寡腺苷酸合成酶(2',5' Oligoadenylate synthetase, 2-5AS)是干扰素(Interferon, IFN)抗病毒、抗细胞增殖过程中的关键酶.由它催化合成的2',5'寡腺苷酸(2-5A)能激活细胞中的内切核糖核酸酶(RNasel)降解病毒的mRNA及细胞的RNA,从而起到抑制病毒复制和抗细胞增殖的作用.病毒感染、注射IFN或poly(Ⅰ):poly(C)都能诱导机体细胞合成2-5AS.因此,该酶可作为一项生化指标用于评价机体IFN系统的抗病毒作用.仅就2-5AS及其与IFN的抗病毒机制、2-5AS临床测定方法、2-5AS在病毒性肝炎的临床意义等作一简要介绍.
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上皮钙粘素基因启动子C/A单核苷酸多态性与膀胱癌的关系研究
采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析( PCR-RFLP)技术分析上皮钙粘素(E-cadherin)基因启动子近侧序列-160 处C/A单核苷酸多态性(SNP),观察SNP与膀胱移行细胞癌的发生、临床分期和病理分级间的关系.现报告如下.
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我国著名眼科专家严密教授逝世
我国著名眼科专家、中华眼科杂志编委、中华眼底病杂志总编辑、国务院政府特殊津贴获得者、四川大学华西医院眼科教授严密因病不幸于2010年1月4日零时32分逝世,享年78内切岁.
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川酱杏仁鸡
做法1)鸡腿去骨去皮,鸡腿内切成2厘米大小的丁,放放碗中,加入盐和淀粉搅匀后腌5分钟.2)马蹄(荸荠)削去外皮,切成2厘米大小的丁.姜去皮切成末.
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拉下式直肠癌切除术术后护理
拉下式直肠癌切除术适用于癌距肛门8~10cm,也是一种保留肛管和括约肌的手术.它不在腹内切断直肠,而在会阴部经肛管内齿状线以上环形切开直肠粘模,在肛门括约肌以上切断直肠.然后将直肠和乙状结肠下端连同癌从肛管内拉出,再在距癌5~7cm处切断乙状结肠,固定于肛门.约10~14天后结肠浆膜面与肛管以上直肠下端肌层粘连愈合[1].此时可将肛门外多余的结肠切除.此手术虽然保留了肛管和肛门括约肌,但控制排便功能较差,且易引起感染和肠腔狭窄,因此手术后护理至关重要,现就其术后护理要点阐述如下.
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MTHFR C677T和CBS T833C G919A基因突变与青年缺血性脑卒中的关系
血浆中同型半胱氨酸(Hcy)水平增高是缺血性脑卒中的独立危险因素.有研究认为,轻中度Hcy浓度增高与脑卒中的发生密切相关.N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶是Hcy代谢的关键酶,胱硫醚β合成酶是Hcy代谢的相关酶,本研究拟采用聚合酶链-限制性内切酶片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和扩增阻滞突变体系法,对血浆同型半胱氨酸(HCY)代谢关键酶N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点和相关酶胱硫醚-β-合酶(CBS)基因T833C、G919A位点碱基突变与青年缺血性脑卒中的关系进行研究.
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透明质酸酶及其在恶性肿瘤的转移与浸润中的作用
透明质酸酶(Hyaluronidase,Hyase)是一种β-1-4内切葡糖胺酸酶,降解透明质酸(Hyaluronan,HA)及其它糖胺聚糖.多年来,由于缺乏简便而敏感的测定方法,Hyase的研究未得到足够的重视,近随着研究水平的提高,发现Hyase与恶性肿瘤的浸润与转移具有密切关系.本文就Hyase的生化特性及其在恶性肿瘤中的作用作一综述.
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061 旋毛虫和伪旋毛虫的E-S产物中单链核酸内切酶的活性
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内外混合痔手术后引起破伤风一例
患者男,24岁.因内外混合痔手术后张口、排尿困难3d于2002年2月7日入院.缘于2002年1月30日在诊所行内外混合痔(内切外扎)手术后,于2月4日晚出现小便淋漓不尽,肛门紧缩感,次日出现张口困难,低热,并逐渐发生频繁的短暂抽搐,于7日下午急诊收住我院.
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热休克蛋白基因多态性与溃疡性结肠炎相关性研究
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因不明的累及结肠黏膜和黏膜下层病变的慢性非特异性肠道炎性疾病,在我国发病率呈上升趋势,其病因可能涉及遗传、免疫、感染、环境等因素;热休克蛋白(heat shock protein,HSP70)作为分子伴侣在抗原的递呈和处理中起重要的作用,具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能.为了探讨HSP70-2基因多态性与UC的相关性,我们采用聚合酶链反应-限制性内切酶方法(PCR-RFLP)对57例UC患者及127例健康正常人进行HSP70-2+1267(A/G)Pst Ⅰ酶切位点基因多态性检测.
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隧道内切核在小切口白内障摘除术中应用
小切口白内障摘除人工晶体植入术,因其切口小,术后恢复快,操作简单,无需特殊器械及设备等优点,在基层医院已广泛开展,其技术成熟、稳定.临床工作中经常见到Ⅳ-Ⅴ级大硬核,由于切口小取核困难,以往多采取扩大切口的方法将核取出,我们在工作中采取隧道内切核法碎核,简便易行,效果满意,现报告如下.
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乳腺癌保乳术后放疗所致重度皮肤反应1例
患者,女,36岁.因发现左乳肿物3天,行左侧乳腺癌扩大切除加前哨淋巴结活检术,术后病理为乳腺浸润性导管癌Ⅱ级,内切缘及外下切缘旁组织查见癌细胞.
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尿道镜内切治疗小儿尿道狭窄的护理
小儿尿道狭窄是常见的疾患,以往行会阴尿道切开或扩张手术治疗,效果较差,并发症较多.用尿道镜切开治疗尿道狭窄,由于小儿护理比成人困难,常影响术后效果.近年来,我院用尿道镜切开治疗尿道狭窄9例,得到好的效果,现总结报告如下.
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激光睑袋整形术240例临床体会
睑袋俗称眼袋,是指下睑皮肤松弛、眶隔脂肪堆积较多及眼轮匝肌肥厚等因素所造成的下睑皮肤下垂且臃肿的征象,是面部组织衰老的形态标志之一.2005年5月~2006年12月,我们采用超脉冲C02激光睑袋整形术(即内切法激光下睑袋成形术)治疗患者240例,取得显著效果.现将结果报道如下.
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手术治疗小儿陈旧性孟氏骨折14 例
目的 探讨小儿陈旧性孟氏骨折的手术治疗方法和疗效.方法 取肘外后方切口入路,从切口内切取筋膜条来重建环状韧带.对合并有桡神经损伤的患者同时作神经外膜切开减压松解术.结果 本组14 例除1 例因受伤时间长达1年,以致桡骨小头向外后方脱位快速生长挤压了桡神经使该条神经变细,术后手指功给恢复差.其余13 例采用上述手术方法均恢复正常功能.结论 小儿陈旧性孟氏骨折在切口内切取筋膜条来重建环状韧带稳定桡骨小头方法可靠.但桡神经损伤时间长是术后恢复不理想的重要原因.关健词:小儿;陈旧孟氏骨折;环状韧带重建
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改良外剥内切术治疗混合痔3lO例
近年来,我们采用改良外剥内切术治疗混合痔310例,取得满意疗效,现报告如下.临床资料:本组男207例,女103例;年龄20~77岁;病程2~40年.并发肛痿29例,肛裂52例.治疗方法:患者取截石位,常规消毒,腰俞穴麻醉.扩肛至肛门松弛.痔核脱出肛门外,用组织钳平行钳夹痔核中心部位,痔核过大者,可左右两端平行钳夹两把组织钳,V形切开外痔核根部皮肤,剥离外痔组织至内痔部位,从痔核右侧开始剪开痔核O.5~1cm,上至正常直肠黏膜,括约肌上方保留少许肛垫组织,切除痔核约90%,创面以7号丝线8字缝合止血,如此边切边缝至痔核完全切除.注意第1针及末1针将创面与肛缘V形皮缘缝合,中心创面缝合于括约肌上的结缔组织,环状痔保留至少3处皮桥,宽约O.5cm以上,如法将所有痔核完全切除.
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外剥内切缝合术治疗老年性混合痔63例
我们采用外剥内切缝合术治疗老年性混合痔63例,取得满意疗效,现报告如下.临床资料:本组男42例,女21例;年龄60~81岁,平均65.8岁;病程3~40年.有痔核脱出症状者51例,既往有痔手术史者31例,伴心血管疾病者35例,其中伴高血压病26例,冠心病、心律失常20例,伴呼吸系统疾病者16例(慢性支气管炎14例、肺气肿2例),伴糖尿病者9例.