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原子吸收分光光度计维修两例
原子吸收光谱法是根据基态原子特征波长的吸收,测定试样中待测元素含量的方法.它在二十世纪六十年代后期不断发展,使得原子吸收法不仅可测金属元素,还可测量一些非金属元素(如卤素、硫、磷等)和一些有机化合物(如维生素B12、葡萄糖、核糖核酸酶等).
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中西医结合治疗消化性溃疡52例的临床观察
消化性溃疡是由幽门螺杆菌(HP)所致,而HP内含有丰富的尿素酶、氧化酶、过氧化酶、DNA酶,核糖核酸酶、酸化磷酶,及谷氨酰胺酶肽等.消化性溃疡及慢性胃炎的发病机制与HP感染和胃酸排出的聚合作用有关:十二指肠黏膜在胃酸过多的刺激作用下,导致黏膜损伤损坏为HP感染提供可能条件,HP生长繁殖又进一步破坏细胞的紧密结合,细胞的损伤使胃酸得以侵入黏膜,致使黏膜进一步损伤,终形成溃疡.
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豹蛙酶的抗肿瘤作用研究进展
豹蛙酶(onconase)又称抗瘤酶、P30 蛋白等,属核糖核酸酶 A超家族成员.豹蛙酶是目前唯一用于临床试验阶段的核糖核酸酶,它的核糖核酸酶活性低,细胞毒性较强,对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的 100 种新药之一.豹蛙酶在北极蛙的早期胚胎中被首次发现,它主要通过破坏RNA从而抑制蛋白质合成,诱导肿瘤细胞凋亡,此外还有其他抗肿瘤机制,如影响特定基因的表达和破坏端粒酶RNA.豹蛙酶和其他抗癌药物联合应用会增强抗癌药物的抗肿瘤细胞毒性.目前,豹蛙酶对小细胞肺癌和其他实体肿瘤的治疗处于Ⅰ期或Ⅱ期临床试验,对恶性间皮瘤的治疗处于Ⅲ期临床试验阶段,是潜在的治疗恶性间皮瘤的药物.
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血管生长素与治疗性血管生成的研究进展
血管生长素(angiogenin,ANG) 是一种分泌性的单链碱性蛋白质,由123个氨基酸组成,分子量为14.4kD,广泛分布在人体中.ANG属于核糖核酸酶超家族中的一员,具有低核糖核酸酶活性.研究证实,ANG是一种有效的促血管生成因子,参与血管生成的各个阶段,是其它血管生成因子诱导新血管生成的枢纽,在缺血性疾病的治疗方面显示出巨大的潜能.本文对ANG在治疗性血管生成方面的研究进展作一综述.
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血管生长素促血管生成机制及其与疾病关系的研究进展
血管生长素(angiogenin,ANG)是一种促使新血管生成的诱导剂,它属于核糖核酸酶超家族中的一员.ANG蛋白含123个氨基酸,相对分子量为14.4kD,在肿瘤细胞中首先发现,也存在于正常细胞中,可由多种细胞分泌,其核糖核酸酶活性较弱.研究证实,ANG可以在细胞间及细胞内发挥促血管生长作用.ANG与缺血性疾病、肿瘤、及其它疾病的关系已见不少报道.本文简述ANG促血管生成作用机制及其与疾病的关系.
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变异链球菌腺苷磷酸硫酸酶的原核表达及功能研究
目的 构建变异链球菌aps基因原核表达载体,表达纯化目的蛋白,继而对其生物学功能进行初步鉴定. 方法 以变异链球菌UA159株基因组DNA为模板PCR扩增变异链球菌aps基因编码区,插入原核表达载体pASK-IBA43 plus,转化E.coli Top 10,无水四环素诱导His-APS蛋白表达,经Ni-NTA纯化后,检测His-APS蛋白腺苷磷酸硫酸酶活性及核糖核酸酶活性. 结果 PCR扩增出933 bp的aps基因开放读码框,成功构建aps基因原核表达载体pASK-aps,并在E.coli Top 10中诱导表达,SDS-PAGE检测重组His-APS蛋白分子质量单位为38 ku,该蛋白在Mg2+及Mn2+存在条件下能水解pAp,且呈时间及浓度依赖性,但不能降解Cy5标记的随机6nt寡核苷酸探针. 结论 重组His-APS蛋白具有腺苷磷酸硫酸酶活性,呈时间及浓度依赖性,但不具有核糖核酸酶活性.
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耐核糖核酸酶内含HCV RNA病毒样颗粒的表达
目的构建可以表达耐核糖核酸酶(RNase)的内含HCV RNA病毒样颗粒的载体质粒. 方法将表达载体pI NCCL用HindⅢ酶切后,与用相同内切酶酶切的HCV RNA非编码区(5′-UTR)扩增产物,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR,再转化BL21-DE3 E.coli进行原核表达. 结果成功构建得到了新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR,经原核表达为耐RNase的内含HCV RNA病毒样颗粒. 结论得到的pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台.
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尿胰蛋白酶原-2快速检测在急诊急腹症中的鉴别诊断作用
胰蛋白酶原(hypsinogen)是胰蛋白酶的前体,由胰腺腺泡细胞分泌.正常胰液分泌的消化酶有两种形式:一种是有生物活性的,如淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶等;另一种是以前体或酶原形式存在的无活性的酶,如胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、前磷脂酶、前弹性蛋白酶、激肽释放酶原和前清肽酶等.
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2',5'寡腺苷酸合成酶及其在病毒性肝炎中的临床意义
2',5'寡腺苷酸合成酶(2',5' Oligoadenylate synthetase, 2-5AS)是干扰素(Interferon, IFN)抗病毒、抗细胞增殖过程中的关键酶.由它催化合成的2',5'寡腺苷酸(2-5A)能激活细胞中的内切核糖核酸酶(RNasel)降解病毒的mRNA及细胞的RNA,从而起到抑制病毒复制和抗细胞增殖的作用.病毒感染、注射IFN或poly(Ⅰ):poly(C)都能诱导机体细胞合成2-5AS.因此,该酶可作为一项生化指标用于评价机体IFN系统的抗病毒作用.仅就2-5AS及其与IFN的抗病毒机制、2-5AS临床测定方法、2-5AS在病毒性肝炎的临床意义等作一简要介绍.
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TatPTD介导HBV靶向核糖核酸酶进入肝细胞的研究
目的:利用HIV-Tat蛋白转导域(protein transductiondomain,PTD)高效的跨膜转导特性,探索将乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)导入肝细胞的新途径.方法:将TR基因克隆入含TatPTD的pTAT原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达并进行纯化.将纯化的Tat-TR加入培养的HepG2细胞,间接免疫荧光法检测其导入HepG2细胞的效率,MTT法检测其对细胞生长代谢的影响.将Tat-TR加入培养的HepG2.2.15细胞,定量PCR法检测HBV DNA水平并以SPSS软件进行统计分析.将Tat-TR经尾静脉注入小鼠体内2 h后,对小鼠肝组织进行免疫组化染色,检测TatPTD能否在体内介导TR进入肝细胞.结果:成功地制备了Tat-TR融合蛋白,其纯度为90%.间接免疫荧光及MTT的检测结果证实Tat-TR可以跨膜导入HepG2细胞且对细胞生长没有影响.SPSS统计分析显示Tat-TR可以抑制HBV的复制.免疫组化染色结果显示,TatPTD在体内也可以介导TR进入肝细胞.结论:Tat-HBV靶向核糖核酸酶的制备及活性鉴定,为应用靶向核糖核酸酶治疗乙肝病毒感染的研究奠定了良好的基础.
关键词: HIV-Tat蛋白转导域 肝细胞 核糖核酸酶 -
不同来源的人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达
目的:研究人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达规律,探讨其耐受内毒素的分子机制,为炎症性肠病(IBD)发病机制的阐明拓宽新的视野和思路.方法:用核糖核酸酶保护法(RPA)检测原代培养人正常肠上皮细胞(HNIEC)和人小肠上皮细胞株(HIC)内毒素相关受体CD14,Toll样受体4(TLR4)和MD-2 mRNA的表达;用免疫组化法检测人正常小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞CD14,TLR4和MD-2蛋白的表达.以表达TLR4,CD14和MD-2的人单核细胞系THP1细胞作为阳性对照.结果:HNIEC CD14、TLR4、MD-2mRNA均呈低表达,HIC CD14,TLR4,MD-2 mRNA均无表达.小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞3种内毒素受体CD14,TLR4,MD-2蛋白均无表达.结论:肠上皮细胞表面CD14、TLR4和MD-2呈低表达或不表达可能是其耐受内毒素作用的重要分子机制之一.
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第五讲胰酶与消化
胰液中的消化酶主要由胰腺的腺泡细胞合成、贮存和释放的.胰液的酶组成非常复杂,胰酶由不同成分按不同比例混合.胰液中蛋白质浓度为0.7%~10%,大部分为酶和酶原,其余为血浆蛋白、胰蛋白酶抑制物和粘蛋白.淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶为三类主要的胰消化酶.在胰腺内除淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶为活性酶外,其余均以酶原形式存在,因而可防止胰腺自身消化.
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槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的实验研究
槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质的热水提取物,临床上证实有一定的抗癌效果。为进一步探讨其抗癌机制,我们研究了槐耳清膏在体外诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡的作用。 材料与方法引进并培养人肺腺癌细胞系A549细胞株。制备不同浓度的槐耳清膏PRMI-1640含药培养液与接种成功、呈对数生长的A549细胞共同培养24 h后,每6 h进行以下观察及测定(设阳性对照组羟基喜树碱100 μg/ml,共同孵育10~12 h后进行测定)[1]。(1)荧光染色:收集培养细胞,清洗并均匀涂片自然风干24 h,置于0.05 mg/L的Hoechst33258及0.1 mg/L的硫柳汞的无钙、镁的磷酸缓冲染色液中作用40 min,封片后荧光显微镜下观察、拍照、计数;(2)电子显微镜观察:同上收集细胞6×106,磷酸缓冲液(PBS)清洗,戊二醛固定,再经锇酸染色、缩水包埋、切片后透射电子显微镜观察照相记录;(3)流式细胞仪分析:同法收集、清洗、固定细胞2×106,离心后加入100 μl磷酸二氢钠/柠檬酸缓冲液室温震荡30 min,在离心的细胞中加入含100 mg/L 核糖核酸酶A(Rnase A)和25 mg/L 碘化丙啶(PI)的染色液1 ml在暗处4℃染色3 h,用FACSort流式细胞仪分析细胞周期。实验数据通过SPSS For Windows软件进行统计学分析。
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牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测
目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(rana catesbeiana ribonuclease, RC-RNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazolium blue, MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果.方法:用异丙基硫代-D-半乳糖苷(isopropylthio-D-galactoride, IPTG)诱导原核表达质粒PET32a-RC-RNase在大肠埃希菌E.coli Bl21(DE3)plysS中表达.菌体经超声、离心后,用Ni-NTA Agarose亲和层析法对包涵体进行纯化.采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性.结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel eletrophoresis, SDS-PAGE)蛋白电泳表明,RC-RNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达.用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44 μg/mL.结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础.
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牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化
目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC-RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化.方法:以PCR方法扩增出RC-RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET-RC-RNase,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化.结果:经IPTG诱导后,SDS-PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在.所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上.结论:重组融合蛋白RC-RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础.
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编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA克隆及序列分析
目的:获得编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列.方法:针对编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从雌性成年牛蛙肝脏中,扩增出编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白的基因序列,并将其克隆入载体pUCm-T中,通过酶切及序列测定鉴定重组载体.结果:经序列测定证实,重组载体含有正确编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列.结论:获得的阳性克隆含有374 bp的重组片段,为进一步深入研究其生物学活性及其抗肿瘤功能奠定了基础.
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电离辐射对不同乳腺癌细胞株端粒酶的影响
端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构,主要由(TTAGGG)n串联组成.它的作用主要是维持染色体的稳定与完整,防止染色体融合.端粒酶是一种反转录酶,是能以自身RNA为模板逆转录合成端粒的核糖核酸酶,使端粒维持一定长度,从而使细胞获得无限分裂的能力.
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人源化免疫毒素的研究进展
免疫毒素是通过化学连接或基因融合的方法将细胞选择性配体与毒素分子相连组成的嵌合体蛋白,它能够靶向肿瘤细胞高表达的肿瘤相关抗原、膜受体和糖蛋白.尽管以细菌毒素或植物毒素为基础的免疫毒素显示出良好的应用前景,但细菌毒素和植物毒素的免疫原性和非特异的细胞毒性等因素,阻碍了它们在临床上的应用.针对这些问题,以人源蛋白如促凋亡蛋白与RNA酶为毒素部分的新一代免疫毒素被研发出来,本文对此类人源化免疫毒素的体内外实验研究进展进行综述.
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蒙古黄芪中核糖核酸酶活性蛋白AmPR-10的纯化和性质研究
目的 采用全自动智能蛋白纯化系统AKTA Avant25建立蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10,AmPR-10)的稳定快速分离纯化方法,并分析其理化性质和生物学活性.方法 蒙古黄芪经Tris-HC1缓冲液浸提后阴离子交换色谱捕获目标蛋白,疏水色谱精细分离,凝胶滤过色谱进一步精细分离得到AmPR-10.采用MALDI-TOF/TOF质谱法测定相对分子质量,质谱检测后MS/MS Ion Search检索鉴定蛋白,高碘酸-Schiff法判断是否为糖蛋白,琼脂糖凝胶电泳分析核糖核酸酶活性及不同影响因素对核糖核酸酶活性的影响.结果 蒙古黄芪粗提液经QSepharose Fast Flow、Butyl Sepharose High Performance和SuperdexTM 75 10/300 GL 3步纯化后可得到电泳纯AmPR-10;质谱测定其相对分子质量为16 801;蛋白鉴定其属于PR-10蛋白家族;糖蛋白染色显示其不含糖链.AmPR-10具有显著的核糖核酸酶活性,且其活性对NaC1浓度、pH值和金属离子的敏感度低,仅0.5 mol/L NaC1、pH 9.0、Mg2+和Co2+对其有微弱的抑制作用,EDTA对AmPR-10核糖核酸酶活性无影响.结论 离子交换色谱-疏水色谱-凝胶过滤色谱3步法纯化AmPR-10快速稳定,可应用于其他中药蛋白质的分离纯化.AmPR-10可能在蒙古黄芪抵御RNA病毒侵染中发挥重要作用.
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不论白萝卜、青萝卜还是心里美萝卜都是难得的抗癌佳品
目前"干扰素诱生剂"的抗病毒、抗肿瘤用途已被国际公认.其有效成分为dsRNA(双链核糖核酸).但人工合成的双链核糖核酸在吞咽过程中极易被降解,静脉注射又易产生副作用,故很难临床应用.我国科学家发现,萝卜中含有抗病毒的活性物质--"干扰素诱生剂".此物质能刺激细胞产生干扰素.特别是萝卜中的双链核糖核酸对口腔中核糖核酸酶的耐受性相当高,吞咽中不易被降解,且无任何副作用.