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3M分子检测系统新的食源性致病菌快速筛选方法
在食品安全与卫生检测中,食源性致病菌的检测越来越受重视,因此全球各国的食品工业中该类项目的检测数量逐年增大.如何准确、快速与简便地检测出产品中的致病菌以适应企业规模化和效率化的发展成为该行业发展中极为关注的焦点.新上市3M分子检测系统将环介导等温核酸扩增技术(LAMP)和生物荧光实时检测技术(BART)结合在一起,这种创新技术全面提升了操作简便性,准确性,检测速度和性价比,在分子层面上实现了针对食源性致病菌准确、高效的检测.其检测灵敏度是普通PCR的10倍,引物设计远比普通PCR更加巧妙,检测结果也更加准确;扩增效率更高,检测时间更短,检测步骤更少,操作中发生人为污染和技术错误的概率大大降低;可以同时检测多个项目,是高通量、多检测项目的技术;实时且自动化的结果判读;对环境要求更低,适用范围更广.
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茎环法与加PolyA尾法PCR在检测MicroRNA时引物设计的策略
MicroRNA (miRNA)是一种长约18 ～ 25个核苷酸的非编码RNA,对基因的表达调控发挥着重要的作用.对于miRNA的实时定量PCR与以往的PCR有些不同,这主要是因为miRNA的自身结构比较特殊.其大的特点就是长度过于短小,仅仅二十几个碱基的核酸片段无法直接应用常规的PCR技术扩增.所以,在针对miRNA的PCR技术中,必须要延长待测miRNA的长度,构建出一个足够长的PCR模板,才能进一步应用PCR技术来定量分析.本文介绍的2种方法,茎环法和加尾法,在原理上有所差异.茎环法的原理是,设计一种特殊的茎环结构的反转录引物,在反转录反应中直接完成模板链的延长;而加尾法的思路则是先对miRNA进行加PolyA尾处理,改造成mRNA的结构,再采用mRNA常用的oligo (dT)反转录引物进行反转录,从而得到较长的模板链.
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虫草属EST-SSR标记系统的建立研究
目的:通过球孢虫草、蛹虫草EST设计EST-SSR引物,建立虫草属EST-SSR标记系统.方法:从NCBI公共数据库下载获得虫草EST,利用Sequece Seiners 1.2软件去除冗余序列并设计引物,进行PAGE电泳.结果:通过去除EST总序列中低质量的和冗余的序列后,得到全长为2 953 173 bp的4 556条无冗余球孢虫草EST.从中发掘出718个EST-SSR,分布于616条EST中,出现频率是15.8％.平均分布频率是每4 096 bp出现1个,三核苷酸重复序列有419个,是出现多的重复类型.蛹虫草EST去冗余后得到1 363条无冗余EST,共含有1 117个EST-SSR,出现频率为81.95％,出现多的重复类型是A核苷酸重复.根据球孢虫草EST-SSR序列,设计合成50对引物,有扩增产物的引物为34对,占总设计引物数的68％.根据蛹虫草EST-SSR,设计合成40对引物,有扩增产物的引物为39对,占总设计引物数的97.5％.基于SSR标记进行聚类分析,7种虫草无性型均能分开,且分为4支.结论:虫草属EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值.球孢虫草和蛹虫草EST开发的SSR标记在虫草属有较好的转移性与通用性,可以很好的应用于虫草种间遗传关系的研究.应用虫草物种EST建立分子标记是一条简便而又有效的途径.
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步，针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段（MSP1-17）的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组［1］。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因进行多态研究时，所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点，通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态［2］。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因（Pfmdr1）片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因，从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在［3］。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素，带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接［4］。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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SEN病毒D亚型中国株流行病学及序列变异
目的了解SEN病毒D亚型中国株的流行病学特点及其进化地位. 方法分析已知的基因序列设计引物,建立半套式PCR检测方法,对58份献血者血清样本和25份non-A～E肝炎患者血清样本进行了SENV-D亚型的检测,并对部分阳性血清的PCR产物进行克隆测序. 结果无偿献血者中SENV-D亚型感染率为45%,在non-A～E肝炎患者中SENV-D亚型感染率为48%,两者间差异无显著性;但在无偿献血者中SENV-D亚型的阳性检出率大大高于国外报道.测序结果经BLASTP软件在GenBank中检索表明,各测序株均与已知的SENV-D株序列有很高的同源性,并在此基础上用MegAlign软件进行进化树分析. 结论建立的半套式PCR检测方法适用于SEN病毒D亚型检测;SENV-D亚型中国株之间以及与已发表的国外SENV-D株序列之间有变异.与无偿献血者相比,non-A～E肝炎患者血清SENV-D株无进化上的显著倾向性.在测序的部分ORF1序列中存在一个核苷酸高变区.
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棒状乳杆菌4个管家基因PCR引物的设计与验证
目的 探索一种为棒状乳杆菌管家基因设计PCR引物的方法,并验证所设计引物的PCR扩增效率和特异性.方法 先用在线引物设计工具Primer-BLAST为棒状乳杆4个菌管家基因设计PCR引物.然后用软件oligo 6.44评价引物的各项参数,综合考虑PCR引物设计的各项原则,人工筛选出佳引物,后通过PCR扩增验证引物的效率和特异性.结果 每个管家基因用Primer-BLAST程序设计得到10对引物,后各选出1对引物.经PCR扩增验证,这些引物不仅效率高,而且特异性好.结论 本研究所用的引物设计方法简单实用,用于设计棒状乳杆菌管家基因PCR引物效果理想.
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错配PCR技术在快速检测耐药结核分枝杆菌中的应用
耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一.利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法,错配PCR法等[1-2].错配PCR技术早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查,目前已广泛应用于基因点突变的检测[3-4].根据PCR引物设计的不同,可将其分为间接错配PCR,即引物与野生型完全互补,以突变株为模板不能扩增得到PCR产物,和直接错配PCR,即引物与特定的点突变完全互补,以野生株为模板不能扩增得到PCR产物.已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道[5-6].本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象,建立了直接错配PCR法,并与间接错配PCR法进行了比较.
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一致-简并杂交寡核苷酸引物设计用于未知病原微生物检测的进展
近年研究发现,暴发的"非典型性肺炎",禽流感及四川发生的猪链球菌感染等要么是已发现的病原微生物家族中的新成员,要么是原来不感染人的动物病原体.因此,快速、及时、准确定性检测这些病原体,对防治疾病具有重要意义.
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髁突软骨的细胞分层及其功能研究
我们通过对髁突软骨细胞进行PCNA、FGFR3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体基因表达等研究,探讨髁突软骨的分层及其功能.1.材料和方法:成年日本大耳白兔共6只,雌雄各半.处死动物后,取TMJ标本, HE染色和免疫组化标本用多聚甲醛固定,EDTA脱钙,石蜡包埋.免疫组化采用超敏SP法.抗FGFR3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司(美国), 抗PCNA单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(购自福州迈新公司).基因序列、引物设计、RNA探针制备和原位杂交方法同以前的研究[1].
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SEN病毒H亚型中国株流行病学及进化研究
目的:了解SEN病毒H亚型中国株的流行病学特点及其进化地位.方法:结合已知的基因序列设计引物,建立了半套式PCR检测方法,对58份献血者血清样本和25份non-A-E肝炎患者血清样本进行了SENV-H亚型的检测,并对部分阳性血清的PCR产物进行克隆测序.结果:检测结果显示无偿献血者中SENV-H亚型感染率为34%,在non-A-E肝炎患者中SENV-H亚型感染率为24%,两者间无显著差异;但在无偿献血者中的阳性检出率大大高于国外报道.测序结果经BLASTP软件在GenBank中检索表明,各测序株均与已知的SENV-H株序列有较高的同源性,并在此基础上用MegAlign软件进行进化树分析.结论:建立的半套式PCR检测方法适用于SEN病毒H亚型检测;SENV-H亚型中国株之间以及与已发表的国外SENV-H株序列之间都有较大的变异.与无偿献血者相比,non-A-E肝炎患者血清SENV-H株无进化上的显著倾向性.
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BioSunLAMP:一个用于环介导等温扩增的引物设计软件
目的 环介导等温扩增法(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型等温核酸扩增方法.由于其具有简便、高效、特异性高和成本低等优点,在甲型HlNl流感和肺结核等流行病检测中得到了广泛应用.在LAMP技术中,关键的起始步骤是设计合适的引物序列.为了让引物设计更加方便与高效,我们开发了LAMP引物设计软件BioSunLAMP.方法 采用Delphi程序设计语言开发了界面友好、便于使用的软件系统.结果 经甲型HlNl流感、结核分枝杆茵实验验证,BioSunLAMP软件设计的引物达到了预期效果.此外,与同类软件相比,BioSunLAMP还具有如下特点:①集引物设计与引物特异性分析于一体,可以通过本地数据库或远程调用NCBI的相关数据库来检查引物特异性;②支持针对多序列的通用引物与特异引物设计.结论 BioSunLAMP软件的开发,为LAMP技术的普及提供了很好的生物信息学支持.
关键词： BioSunLAMP LAMP 引物设计 -
电离辐射对小鼠骨髓基质细胞分泌的干细胞因子mRNA转录的影响
骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BMSC)是造血微环境的重要组成成分，也是产生造血活性物质所必需的结构基础，同时也能分泌多种造血因子。BMSC受到辐射损伤后，M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-5等造血因子mRNA水平发生了变化［1］，但对于其分泌的造血调控的重要细胞因子——干细胞因子(Stem cell factor,SCF)在放射损伤后其mRNA水平有什么变化，以及这些变化与造血功能障碍之间是否有关系，至今尚未见报道。本文作者观察了体外培养的小鼠BMSC在受到不同剂量60Co γ射线照射后，其SCF mRNA转录水平的变化，以期探讨放射损伤后造血功能障碍的机理。 一、材料和方法 1.实验材料：健康雄性昆明小白鼠，体重18～22 g，本校实验动物中心提供。总RNA提取试剂盒(GIBCO BRL)，10×SYBR Green PCR buffer(PE Applied Biosystems),Taq酶、m-MLV等均为上海生物工程公司代理产品。 2.引物设计：由Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd合成，序列顺序为：上游引物：5′-ATCTGCGGGAATCCTGTGACTG-3′，下游引物：5′-CCATATCTCGTAGCCAACAATGAC-3′。 3.BMSC培养：参照Dexter's介绍的方法［2］进行BMSC培养。每周半量换液，至贴壁细胞长满为止(约3～4周)。
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通用引物策略提高Adeno-XTM腺病毒表达系统中连接克隆的筛选效率
AdEasy是目前应用广泛的腺病毒构建系统,其采用细菌Escherichia coli(BJ5183)进行同源重组,虽然提高了效率,但需进行电击转染和阳性克隆筛选.ClonTech 公司的Adeno-XTM腺病毒表达系统采用归位内切酶(I-Ceu Ⅰ和PI-Sce Ⅰ),将穿梭质粒pShuttle-Vector上的目的基因直接连接到病毒骨架质粒上,省去了重组克隆的筛选,缩短了构建时间.
关键词： Adeno-XTM腺病毒表达系统 通用性引物 引物设计 克隆 -
原发性膀胱移行细胞癌p15及p16基因缺失的研究
在人类多种类型的肿瘤中频繁出现染色体9p21-22区域改变[1],这提示该区的改变可能与肿瘤的发生、发展有关.p15、p16基因位于该区,为阐明其在原发性膀胱移行细胞癌(TCC)中的作用,作者对其在膀胱TCC中的缺失改变进行了研究.一、材料与方法1. 标本来源:38例病理检查证实的原发性膀胱TCC和9例正常膀胱粘膜标本由近两年武汉大学中南医院泌尿外科手术获取. -70℃冰箱速冻保存, 以供提取DNA.2. DNA提取及聚合酶链反应(PCR)方法建立:组织DNA提取依常规方法进行.正常膀胱粘膜DNA作对照,3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作内对照,扩增p15、p16基因2个外元,即外元1和外元2.引物设计: p15E1: 5′ CGGAGCA-GCGTGGGAAAG3′, 5′CTGGATCGCGCGCCTCCC3′; p15E2: 5′GCTCCACCTGCCTTGCCCCG3′, 5′ATTAGGTGGGTGGGGGT-GGG3′; p16E1: 5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′, 5′GCGCTA-CCTGATTCCAATTC3′; p16E2: 5′CATTCTGTTCTCTCTGGCAG-3′, 5′CTCAGATCATCAGTCCTCAC3′.反应体系50 μl,模板DNA0.2 μg,MgCl2 1.5 mmol/L,KCl 50 mmol/L,Tris·Cl 10 mmol/L,dNTP0.2 mmol/L,每对引物各20 pmol/L,混匀后液体石蜡覆盖在PCR 扩增仪(GeneAmp PCR system 2400,美国Perkin-Elmer公司)上扩增.扩增条件:95℃预变性5 min,55℃加 Taq DNA多聚酶1.25U,接着94℃,60 s;48℃～55℃,60 s;72℃,60 s;35个循环,后72℃延伸5 min.扩增产物在2.0%醇脂糖凝胶电泳紫外灯下观察,分析缺失结果.
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绵枣儿核核糖体DNA ITS序列扩增的研究
采用通用引物扩增绵枣儿核核糖体DNA ITS序列,未得到目的条带.根据引物设计原则自行设计12个引物,其中只有使用引物对PA3、D(ITS3),PA4、D(ITS3),PA4、DO2扩增得到绵枣儿核核糖体DNA ITS序列.
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应用创造酶切位点PCR-RFLP检测POT1基因rs1034794位点多态性
目的 建立人端粒保护蛋白1 (protection of telomeres 1,POTl) rs1034794位点多态性的检测方法.方法 应用创造酶切位点法(created restriction site PCR,CRS-PCR)根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计PCR引物.其中1条引物根据突变位点邻近序列设计,引入错配碱基,使得引物3'端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成1个酶切位点,PCR产物用PCR-限制性片段长度多态性(PCR restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法进行分析.结果 设计1对特异引物,其中正向引物3'末端与多态相邻,倒数第三位碱基为错配碱基A可在PCR扩增后与多态T等位基因及相邻片段形成AGCT结构,使用限制性内切酶AluI酶切效果较好.结论 应用CRS-PCR方法创造的酶切位点可以有效而简捷地检测POT1 (rs1034794)基因多态性.
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pres基因打靶载体同源臂的PCR引物设计
目的:设计pres基因打靶载体同源臂的PCR引物.方法:在对pres基因结构和功能进行分析之后,选取目标扩增区域进行针对性的酶切位点分析,基于引物设计原则.在符合酶切位点要求的区域内设计同源臂PCR引物.结果:用于构建打靶载体同源长短臂的引物设计符合研究要求.结论:在考虑引物设计原则和酶切位点分析的基础上,可成功设计打靶载体同源臂PCR引物.
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遗传性对称性色素异常症一家系的DSRAD基因突变鉴定
遗传性对称性色素异常症(DSH,MIM127400)是一种好发于四肢末端的色素沉着伴色素减退的常染色体显性遗传病.2003年高敏等[1]将DSH的致病基因定位到1q11-1q21上,姜祎群等[2]和李明等[3]近也证实了这一结果.我们发现一个DSH家系,通过引物设计、PCR扩增和直接测序,分析了该家系DSRAD/ADAR1基因的致病性突变.
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单纯疱疹病毒Ⅱ型PCR检测引物设计及其价值探讨
生殖器疱疹(GH)大多是由单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染所致.主要通过性接触传播.其发病率迅速上升,成为人们关注的公共卫生问题[1].现今生殖器疱疹不典型表现和无症状感染相当多见[2].建立一种快速、简便、特异的检测HSV-2的方法很有必要.糖蛋白D(gD)为HSV-2主要的激活机体免疫的抗原,本试验针对HSV-2糖蛋白D基因序列设计引物并扩增的片断,均符合进一步克隆重组载体表达的要求,所以为研究HSV-2基因疫苗提供了有利的条件.现将结果总结如下.
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利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌
目的:建立基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的霍乱弧菌快速检测方法,为霍乱疫情监测与预防提供及时的应急检测服务和参考结果.方法:通过Genbank检索、下载霍乱弧菌ctxA基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相关核酸序列分析软件比对分析确定目标序列,使用PrimerExplorer v4软件设计霍乱弧菌LAMP引物.以SYBR Green I作为荧光剂在荧光定量PCR仪上实时检测LAMP反应结果,作为本研究的主要研究方式.通过优化反应温度、时间、组成浓度等实验条件对LAMP检测方法进行改进,并与PCR方法进行比较与评价.结果:从分属不同种属的20株实验菌株中分别正确地检出所有5株产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株,对菌株纯培养物的检出限达到了5 cfu/μl(10 cfu/reaction).结论:本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法是一种灵敏、特异、快速、简便的霍乱弧菌检测方法,适于基层单位推广使用,对霍乱疾病监测与暴发后疫情应急检测具有重要意义.
