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严重急性呼吸综合征相关冠状病毒检测探针制备及组织原位杂交
严重急性呼吸道综合征(SARS)的流行暴发引起了世界范围内对SARS病原体的分离及发病机制的研究.国内外多个研究机构报道一种新型的冠状病毒为SARS的致病因子[1-3].于部分患者的血液、呼吸道分泌物、粪便中检测到这种病毒的存在,或血清中具有该病毒的抗体产生[4-6].这对SARS的诊断和治疗都具有重要的意义.但直接于患者的病变组织中检测SARS病毒的报道较少.我们尝试从病变组织中检测SARS病毒.
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鸡胚Bmp4和Cath1原位杂交RNA探针的制备
目的介绍一种鸡胚原位杂交探针制备方法。方法携带Bmp4和Cath1基因特异片段的质粒载体,通过质粒小提试剂盒扩增,限制性内切酶线性化,酚氯仿抽提纯化, T3 RNA聚合酶体外转录,合成地高辛标记的反义探针,通过电泳及鸡胚原位杂交检测探针的质量。结果获得了效果良好的Bmp4和Cath1的RNA探针。结论用质粒小提试剂盒对质粒载体扩增,进而通过线性化、纯化、转录等步骤来制备原位杂交探针的方法,具有时间短、费用低、质量高、杂交效果好等优点。
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髁突软骨的细胞分层及其功能研究
我们通过对髁突软骨细胞进行PCNA、FGFR3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体基因表达等研究,探讨髁突软骨的分层及其功能.1.材料和方法:成年日本大耳白兔共6只,雌雄各半.处死动物后,取TMJ标本, HE染色和免疫组化标本用多聚甲醛固定,EDTA脱钙,石蜡包埋.免疫组化采用超敏SP法.抗FGFR3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司(美国), 抗PCNA单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(购自福州迈新公司).基因序列、引物设计、RNA探针制备和原位杂交方法同以前的研究[1].
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从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA方法的总结
在分子生物学实验的操作中,许多情况下要利用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳观察、纯化和回收DNA片段。DNA片段回收是其中的重要步骤,根据实验的目的不同,回收的DNA可用于载体连接、基因重组、序列分析、探针制备等后续工作。 DNA回收技术操作简单而迅速,并且能分离用其他方法(如密度梯度离心等)不能满意分离的DNA片段。在实际工作中,根据实验需求,准确、简便、快速、经济的DNA片段回收方法更受操作者的青睐。现总结从凝胶中回收DNA常用的方法,不需要特殊的仪器和试剂。
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胶体金探针制备及滴金免疫法检测产肠毒素金葡菌
滴金免疫测定法(dotimmunogo1dfiltration assay,DIGFA)是近年来发展起来的一种以胶体金为标记物的快速斑点免疫结合试验[1],抗原、抗体通过渗滤在膜上进行反应.该法具有与一般酶联免疫吸附法(ELISA)相同的特异性和灵敏性,但操作更简便,不需洗涤,快速,斑点色泽鲜艳,结果易于判断以及不需特殊仪器设备等优点.
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PTEN基因第5、7、8外显子的克隆、探针制备及其在子宫内膜癌中的应用
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,近年来发病率明显上升.其中Ⅰ型子宫内膜癌为雌激素依赖型,占子宫内膜癌的80%以上.研究表明,PTEN基因与Ⅰ型子宫内膜癌密切相关,在所有目前已明确的子宫内膜癌相关基因中PTEN基因突变率高,其突变位点多集中在第5、7、8外显子.从遗传学角度探讨PTEN基因多态性与Ⅰ型子宫内膜癌的相关性国内外对此研究较少.因此,本研究选择PTEN第5、7、8外显子作为检测对象,应用自行制备的PTEN第5、7、8外显子特异性探针检测Ⅰ型子宫内膜癌组织中这3种外显子的基因型,研究抑癌基因PTEN多态性与Ⅰ型子宫内膜癌组织的相关性,以期为早期筛查内膜癌易感人群及为内膜癌的早诊断、早治疗及其个体化的诊治方案提供一个平台.
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褪黑素受体mRNA检测方法的建立
1 方法介绍1.1 组织标本制备待检新鲜组织标本立即用4%多聚甲醇DEPC液固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋组织,置4℃冰箱贮存待检测.1.2 原位杂交检测方法1.2.1 载玻片的预处理载玻片盐酸浸泡24 h,流水洗净,蒸馏水洗后晾干,用95%乙醇浸泡30 min,180℃烘干过夜,室温冷却,涂切片粘合剂.1.2.2 探针制备 LB培养基各50 ml,分别加入mt1、和MT2受体探针大肠杆菌菌株甘油保存液各15 μl,37℃,200 r/min培养过夜.10 000×g离心5 min回收大肠杆菌,按照华舜公司质粒抽提纯化试剂盒说明抽提纯化质粒,将两种质粒以XhoⅠ、HindⅢ内切酶酶切消化2 h,琼脂糖凝胶电泳,回收1.1 kb左右的片段胶,地高辛标记探针(按宝灵曼公司说明书进行),并测定标记效率,探针浓度均达到80 ng/μl.
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人白细胞介素17基因探针制备、克隆及在冠心病中的应用
为探讨人白细胞介素17冠心病在发生发展中的作用.我们应用逆转录多聚酶链反应技术,利用自行设计合成的引物,从植物血凝素活化的正常人外周血单个核细胞中,扩增出人白细胞介素17基因,成功构建了人白细胞介素17基因重组体,经测序确认为人白细胞介素17基因,同时利用随机引物标记基因探针,经核酸杂交显示冠心病患者人白细胞介素17 mRNA表达明显增加,其相应血清标本中可溶性细胞间粘附分子-1含量亦增高.说明人白细胞介素17在冠心病发病机制中起着重要作用,并为进一步研究人白细胞介素17的生物功能提供可靠的物质基础.[主键词] 白细胞介素17;DNA探针;核酸杂交;克隆, 分子;冠状动脉疾病
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弓形虫不同分离株α-Tubulin和β-Tubulin基因PCR-RFLP分析及其探针制备
目的不同分离株弓形虫α-Tubulin和β-Tubulin基因的PCR-RFLP分析及其杂交探针制备.方法PCR体外扩增α-Tubulin和β-Tubulin基因片段并进行RFLP分析;采用随机引物法用地高辛(DIG-11-dUTP)标记探针并同基因组DNA进行Southern杂交分析.结果从5株弓形虫分离株的基因组DNA中均扩增出α-Tubulin基因的818bp片段和β-Tubulin基因的959bp片段,RFLP分析弓形虫各分离株间酶切图谱未见差异.探针的特异性和敏感性较好.结论α-Tubulin和β-Tubulin基因在弓形虫中高度保守;α-Tubulin和β-Tubulin基因杂交探针可用于Southern杂交.
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基因芯片中60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒探针的制备
目的用合成仪合成60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒的探针来制作寡核苷酸基因芯片.方法根据寡核苷酸探针的制作要求,选取SARS冠状病毒的特异序列30条、长度为60 mer的片段进行合成,并对合成后的纯化方法与条件进行探索.将经12%变性PAGE胶纯化后的探针直接点样制备成12×12阵列的寡核苷酸的基因芯片,初步与处理后的临床样品进行杂交.结果经PAGE纯化的寡核苷酸探针的纯度高,能满足寡核苷酸芯片制备的要求.临床SARS患者标本进行处理后与寡核苷酸芯片杂交、扫描检测,效果较好.结论该室合成的60 mer的寡核苷酸SARS冠状病毒探针能用于基因芯片的制备与检测,这为该疾病的实验室诊断提供了一种快速、平行的检测方法.