应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的 根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法.方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株.结果 分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增.敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交.应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符.结论 应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值.

应用PCR-寡核苷酸探针快速检测结核分支杆菌耐药基因突变

目的:结核分支杆菌耐药是结核病治疗中的棘手问题,由于传统的药敏试验方法烦琐而费时,因此,本研究通过快速检测结核分支杆菌耐药基因突变,以期建立一种敏感、特异、简便、快速的分子药敏试验方法,指导临床化疗.

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的研究以16S-23S rDNA内转录间隔区(intemal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种.方法应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株.结果分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp～450bp范围DNA片段.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的.5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平.结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值.

基因芯片在传染病分子流行病学中的应用

基因芯片是指固定有许多有序列的寡核苷酸探针的载体,通过杂交检测,对各种基因进行分析[1].由于它所具有的高通量性、快捷、便宜等优点,在各个领域起着越来越重要的作用,其中也包括分子流行病学领域.基因芯片主要用于菌株的地理流行病学分析、菌株的重要分子特征相关的流行病学分析--分子流行病学的病因学研究及传染病的诊断与鉴别诊断.本文主要从芯片的原理、应用及所存在问题等几方面,初步探讨基因芯片在传染病流行病学应用中的广阔前景.

利用寡核苷酸微阵列技术对HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19进行同时监测的初步研究

探讨研制能同时检测HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19的微阵列监控芯片.根据病毒公开发表序列,序列比对,得出保守区域,设计病毒的特异性检测探针,同时设置阴性、阳性参照探针,制备监控微阵列.利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析.通过对质粒或模式分子的检测以及经HBV、HCV、HIV临床标本的验证,发现该微阵列监控芯片具有良好的特异性.其对质粒的检测灵敏度可达102病毒拷贝数,对临床标本的检测灵敏度可达103病毒拷贝数.此外,该微阵列监控芯片可检测出病毒混合感染血清.为微阵列监控芯片应用于此六种血液病毒的检测打下一定的基础.

寡核苷酸探针芯片快速进行原肺癌P53序列分析

筛选家蝇抗菌肽相关基因的oligo探针设计

目的 设计筛选家蝇抗菌肽相关基因的寡核苷酸(oligonucleoide)探针.方法 用生物学软件Array Deigner 2.0,结合NCBI开发的免费生物信息学软件,对GenBank数据库中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守序列设计特异性高、Tm 值接近、长度均一的oligo探针.结果 共设计出372条oligo探针,长度为50 bp,GC含量为40%～60%,Tm为70～75 ℃.结论 用GenBank数据库资源,结合生物学软件Array Deigner 2.0及NCBI中相关生物信息学软件能快速而有效地设计出筛选家蝇抗菌肽基因的探针.

高性价比寡核苷酸基因表达谱芯片的制备方法

目的 探讨探针长度对寡核苷酸(Oligo)基因芯片杂交信号的影响.方法 以大肠杆菌基因表达信息作为实验模型,根据已有大肠杆菌全基因组芯片数据选择覆盖高、中、低杂交信号强度的20个大肠杆菌基因,针对该20个基因分别设计59-mer和70-mer长度Oligo探针,并将2种探针点制在同一张芯片中,同时设阳性对照探针和阴性对照点样液.提取大肠杆菌RNA,经过反转录、扩增、荧光标记后与芯片进行杂交反应,采用激光共聚焦扫描仪扫描芯片,利用数据分析软件提取探针的杂交信号值并进行显著性分析.结果 大肠杆菌28S rRNA和18S rRNA条带清晰,无降解带出现,质量合格.芯片杂交结果显示59-mer和70-mer长度探针的杂交效率和杂交信号差异无统计学意义(P=0.9810),阳性对照探针出现阳性杂交信号,阴性对照点样液未检测到杂交信号,符合质控要求.结论 59-mer长度探针可用来制备Oligo基因芯片,这不仅降低了基因芯片制作成本,而且将推动基因芯片技术更为普及的应用.

HBV拉米夫定耐药株及BCP、Pre-C突变株芯片检测方法的应用研究

目的 构建针对HBV拉米夫定耐药株及c区启动子(basal core promoter,BCP)、前C区(Pre-C)突变株,多位点突变的基因芯片检测方法.并与DNA测序法比较,以了解该芯片的灵敏度、特异性、稳定性等性能并初步应用于临床实践.方法 该基因芯片能对HBV DNA及P区(DNA多聚酶区):180、204、207三个拉米夫定耐药突变位点;C区启动子(basal core promoter,BCP)及前C区(Pre-C):nt1896、nt1899、nt1862、nt1764、nt1762 5个突变热点,共8个HBV突变位点进行检测,并用测序法对该基因芯片进行验证.结果 ①检测HBV DNA方面,两种方法检测结果100%相符.②检测突变位点方面:总体统计32份阳性血清共有256(32×8)个突变位点.两种方法检测结果有251个突变位点完全相符;5个突变位点不完全相符,基因芯片法检测为混合型,测序法检测为野生型或突变型之一.结论 结果提示该基因芯片和DNA测序法检测结果阳性率无差异,特异性与DNA测序法相当,检测混合株有更大优势.

单增李斯特菌检测基因芯片的研制与评价

目的 研制快速、特异、灵敏的检测单增李斯特菌的基因芯片.方法 选择gyrB、ISR、16S rRNA、23S rRNA、hlyA、iap和prfA作为单增李斯特菌的检测靶基因,研制一种Oligo探针基因芯片,对18个不同种属来源的已知参考生物样品进行检测和鉴定,并且采用对比试验、重复性试验、灵敏度试验和特异性试验对该芯片进行验证评估.结果 通过对比发现IDT合成的70 mer Oligo芯片探针在芯片打印与芯片检测两个方面较优.比较10、40和80 μmol/L 3个Oligo探针点样浓度,结果 显示10 μmol/L的探针点样浓度已能获得很好的芯片检测结果.单增李斯特菌检测芯片具有较好的重复性；样品检测绝对量下限为0.9 ng DNA左右.结论 Oligo基因芯片可以快速准确地检测单增李斯特菌.

天然菌斑生物被膜中变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌的荧光原位检测

目的 检测菌斑生物被膜初期形成过程中的变形链球菌(Streptpcoccus mutans)、远缘链球菌(Streptpcoccus sobrinus)和血链球菌(Streptpcoccus sanguis).方法 从植入釉质磨片表面获得完整的菌斑生物被膜标本,应用激光共聚焦扫描显微镜和荧光原位杂交技术相结合的方法,对天然菌斑生物被膜形成初期的变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌进行原位的、实时的动态观察,通过连续断层扫描及三维重建,观察这3种菌在天然菌斑生物被膜中的空间分布,测量3种细菌的扫描厚度.实验中的扫描厚度结果采用方差分析方法进行统计处理,SPSS11.5统计软件辅助完成,α设在0.05.结果 在激光共聚焦扫描显微镜下观察生物被膜呈三维立体结构,形态多样,生物被膜内层和外层细菌较稀疏,中间层较密集,细菌之间可见许多黑色空隙,贯穿整个生物被膜.菌斑生物被膜变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌在菌斑生物被膜形成初期的平均扫描厚度随时间延长而增加,1 h时平均扫描厚度分别为20.43、11.50、14.76 μm,到24 h时平均厚度大,分别为70.25、75.40、79.98 μm.结论 应用荧光原位杂交技术结合激光共聚焦扫描显微镜,可以快速、灵敏地检测出菌斑生物被膜变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌.

膜芯片技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究

目的 建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(RLB)快速同时检测泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)、淋病奈瑟菌(Ng)和3种支原体感染的方法.方法 分别选择Ct隐蔽质粒和Ng 16S rRNA基因设计两对特异性引物,以支原体内转录间隔序列(ITS)设计一对支原体属通用引物,生物素标记下游引物.构建三重PCR同时扩增Ct、Ng、解脲脲原体(Uu)、微小脲原体(Up)、人型支原体(Mh)等菌DNA,然后与固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交.并对142份经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Ct和Ng的性病高危人群标本,以及45份经支原体液体培养法鉴定的标本进行检测.结果 多重PCR可同时扩增Ct、Ng、Uu、Up和Mh标准菌株DNA,其PCR产物的片段长度为208～408 bp.97份FQ-PCR Ct阳性标本中有93份经多重PCR-RLB检测为Ct阳性,45份FQ-PCR Ct阴性标本中35份多重PCR-RLB阴性.41份FQ-PCR Ng阳性标本中34份多重PCR-RLB Ng阳性,101份FQ-PCR Ng阴性标本中98份多重PCR-RLB阴性.其中36份经多重PCR-RLB检测为混合感染.32份支原体液体培养阳性标本中28份多重PCR-RLB阳性,13份支原体培养阴性标本经多重PCR-RLB检测均为阴性.结论 多重PCR-RLB可快速同时检测Ct、Ng、Uu、Up和Mh,为性传播疾病的临床诊断提供了一种可靠的方法.

PCR结合寡核苷酸探针杂交检测临床常见真菌的实验研究

目的建立PCR结合生物素标记的寡核苷酸探针斑点杂交技术，鉴定临床常见的真菌。方法首先用真菌通用引物扩增白念珠菌、热带念珠菌、假热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、解脂念珠菌、克鲁斯念珠菌、季也蒙念珠菌、黄曲霉、烟曲霉的核糖体大亚单位基因的保守区序列，然后用生物素标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交。并将此方法用于临床标本和临床分离菌株的检测。结果通用引物可以扩增上述11种临床常见真菌的DNA，扩增片段长度在260bp左右。9种特异性探针分别与11种真菌标准菌株的PCR扩增产物杂交，结果表明每种探针都具有高度特异性。斑点杂交法和Southern杂交法检测敏感性相同，为100fg；琼脂糖凝胶电泳法检测敏感性为1pg。通过69例临床标本和31例临床分离菌株的检测，PCR-杂交法的结果和真菌培养法的结果基本一致。结论 PCR结合生物素标记的寡核苷酸探针杂交技术可将9种临床常见真菌鉴定到种，方法快速、敏感、特异。

多重探针连接依赖式扩增快速检测染色体非整倍体异常

目的 评价多重探针连接依赖式扩增(muhiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)在常见染色体非整倍体异常及其在产前诊断中的应用价值.方法 收集经染色体核型分析证实的12例21三体、1例(45,X)、1例(47,XYY)患者,8名正常健康人外周血标本和4例21三体胎儿脐带血标本及1例21三体胎儿羊水、7例核型正常胎儿羊水,共计34份样本.提取外周血或脐带血基因组DNA,羊水标本蛋白酶K消化获得细胞裂解液,采用MLPA技术检测34份标本13、18、21、X和Y染色体拷贝数的变化.结果 48 h内即可完成样本分析.除1份离心后含大量红细胞的羊水标本经MLPA分析后提示(69,XXY)或母血污染外,其余33份外周血、脐带血或羊水标本报告均与染色体核型分析结果一致,临床符合率97.1%.正常二倍体标本Ratio值除Y染色体相对拷贝数变异略大外,其余均接近于1.0.经单因素方差分析,21三体和正常二倍体标本的Ratio均值间差异有统计学意义(F=298.906,P=0.000).结论 高灵敏度MLPA技术结合计算机辅助数据分析方法操作简便、快速、可自动化,是诊断常见染色体非整倍体异常的可靠方法.

原位杂交检测豚鼠巨细胞病毒mRNA方法的建立

人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染对子代的影响越来越引起人们的重视[1],但是,HCMV宫内感染机制尚不明确.由于CMV具有严格的种属特异性,其动物模型中,豚鼠巨细胞病毒(guinea pig cytomegalovirus,GPCMV)感染的表现与HCMV感染极为接近,且可经胎盘垂直传播导致宫内感染,有研究者已经建立GPCMV宫内感染动物模型探讨HCMV的宫内感染机制[2,3].本研究采用地高辛标记的三相寡核苷酸探针进行原位杂交,从病毒基因转录水平检测豚鼠亲代和子代标本中GPCMV晚期mRNA,在基因水平上建立一种稳定、快速、敏感、特异、安全且易于操作的分子杂交试验方法,为GPCMV宫内感染模型的全面、深入研究提供有价值的试验手段.

应用聚合酶链反应-寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变

目的应用聚合酶链反应(PCR)-寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变,建立一种新的分子药敏试验方法.方法以传统药敏试验、PCR-单链构象多态性和PCR-直接测序方法为对照,对利福平、链霉素(SM)和乙胺丁醇耐药的结核菌基因rpoB、rpsL、rrs 和embB的寡核苷酸探针,通过反向斑点杂交检测78株结核菌临床分离株PCR产物.结果 18株结核菌药物敏感株的4种耐药基因均为野生型.60株结核菌耐药分离株中,59株为耐RFP株,rpoB基因突变率为93.2%,常见的突变位点为531位和526位密码子,33株为耐SM株,rpsL基因突变率为75.8%,均为43位密码子AAG→AGG突变,rrs基因突变率为9.1%,均为513位A→C突变,rpsL和rrs基因总突变率为84.8%;43株为耐EMB株,embB基因突变率为58.1%,均为306位密码子突变.结论应用PCR-寡核苷酸探针反向斑点杂交技术可简便、快速、准确地分析大多数结核菌耐药基因突变,检测其耐药性.

用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性

本研究采取的方法是针对耐药性基因突变情况设计相应的探针,然后将合成好的寡核苷酸探针点阵,并固定于玻璃片表面制作DNA芯片,通过杂交的方法对结核分枝杆菌(TB)异烟肼耐药性进行检测.报告如下.一、材料与方法1.TB菌株均由上海市肺科医院提供,40株耐异烟肼菌株,5株异烟肼敏感株,1株标准株(敏感株H37RV),均已通过常规的耐药性检测.

分子灯塔技术及其在基因检测研究中的应用

　　分子灯塔(Molecular beacons)是近年兴起的利用核酸杂交技术对核酸分子进行检测的新技术，由纽约市公共健康研究协会的Tyagi等［1］于1996年首先建立。因其在与核酸分子互补结合之后荧光素便能开始发光，故称为“分子灯塔”。它的建立为研究核酸分子的组成、含量及对PCR过程中进行实时监测提供了快速、特异、方便的新方法，在基因检测领域有着广阔的应用前景。现试就其构成、原理、热力学特性、优缺点及在基因检测中的应用作一简要综述。　　一、分子灯塔的构成、原理及热力学特性　　分子灯塔是具有“发夹”样结构的单链寡核苷酸探针，一般为含20～30个核苷酸的2部分组成：环状部分及茎部。环状部分为单链核酸，与目标链形成特异的互补结合，茎部的2条核苷酸链互补，形成双链分子，大多含有5对碱基。茎部的末端分别与荧光素(5′端)和淬火物质(3′端)结合，淬火物质大多为4-4′二甲氮基苯偶氮苯甲酸，荧光素和淬火物质因研究目的不同可自行设计。茎部的双链互补结构使末端的荧光素和淬火物质紧靠在一起，因荧光素共振能量转移［2］作用而使荧光被吸收，这样荧光素就不能发光。当分子灯塔的环状部分与目标链特异性结合时，所形成的杂交分子比茎部双链结构更稳定，它的刚性使茎部双链分子分离，也就使荧光素和淬火物质相分离，通过自发构型重组作用，在室温下就可使荧光素发光得以恢复，通过荧光仪或合适配置的显微镜可观察到。在分子灯塔与目标链结合的过程中，因环境温度的不同，存在着3种不同的状态：在低温时与目标链结合，即为结合态，当温度升高至42℃时，分子灯塔与目标链的复合物变性，成为“发夹”样结构，导致荧光强度的下降。当温度升高至54℃时，出现茎部结构的变性，分子灯塔成为松散的随机卷曲状态，荧光强度上升。相比之下，如果分子灯塔与目标链有一个核苷酸不能互补，则解链温度要相应地下降约14℃［3］。

膜反向点杂交技术在HIV-1耐药性点突变检测中的应用

目的 以HIV基因组pol区序列为靶基因设计可鉴别HIV耐药性突变的寡核甘酸探针对,应用膜反向点杂交技术检测HIV-1耐药性点突变.方法 以临床提取HIV-1患者血清为模板,扩增产物与点在尼龙膜上的5对特异的寡核苷酸探针杂交.通过标记在PCR上游引物5'端的荧光素显色得到结果,并将其与测序结果进行对比.结果 采用反向点杂交共检测了9例野生型和21例突变耐药型样本,检测结果与测序结果符合率为74%.5对探针对于野生型和突变型的扩增产物均有较好的区分性,敏感性高且信号强弱与相应产物在样本所占比例相关.结论 应用膜反向点杂交技术检测HIV耐药性点突变敏感、简便、快速,具有较高应用价值.

HLA复合体与乙型肝炎的关系

宿主在乙型肝炎病毒(HBV)感染后不同的临床发展过程,从一过性的抗原血症、自限性的急性肝炎、慢性病毒携带、亚临床肝损害、进行性肝损害乃至肝硬变,除了与病毒本身的因素外,更重要的是由于不同个体对HBV所发生的免疫反应的不同[1-14].人类的主要组织相容性复合体(MHC)是编码人类白细胞抗原(HLA)的基因群,称为HLA复合体,为目前已知的复杂的人类基因复合体.研究资料提示,与免疫因素有关的HLA可能影响HBV感染后的不同转归.