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聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究
目的建立聚合酶链反应-增强化学发光法(polymerase chain reaction-enhanced chemiluminecence,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法.方法以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交.结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fg DNA分子.ECL体系灵敏度为0.5pg DNA分子.采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌.结论建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成.
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43例肺科病人痰BACTEC法培养结核分支杆菌时污染菌种的分析
目的探讨肺科病人痰BACTEC法培养污染菌种分布特点，以期更好地控制污染，降低污染率。方法对1997年10月至1999年1月收治的650例肺科病人痰标本BACTEC法培养污染标本，用常规普通细菌培养鉴定方法进行分离鉴定，并对结果进行分析。结果 650例肺科病人痰BACTEC法培养标本中，污染43例，总污染率为6.6%(43/650)。对43例污染标本进行普通细菌培养鉴定，共分离出12种菌株，其中4例培养出2～3种菌株，共得48株。以枯草杆菌和微球菌为主，分别为16株(33.3%)，9株(18.8%)。另外，还分离出金黄色葡萄球菌6株(12.5%)，白色念珠菌3株(6.2%)以及革兰阴性杆菌14株(29.2%)，且分为7种细菌。结论 (1)实验室污染仍为主要污染源，应加强严格的无菌操作。(2)革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌共占到47.9%(23/48)，提示与肺部感染及口咽部病原菌污染有关［1］，建议临床加强肺部炎症控制。
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煤工尘肺结核耐药菌的基因分析
目的了解煤工尘肺结核患者所染结核杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素耐药情况和基因突变情况,试图寻找有效的预防和诊疗方法.方法从96份煤工尘肺结核患者痰标本中分离出64株耐异烟肼、利福平、链霉素及乙胺丁醇的结核杆菌,并用聚合酶链反应--单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)扩增出katG、rpoB及rpsL片段,再将这些片段的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图与标准株的电泳图进行对照分析.结果常规药敏试验检测出各种耐药株共64株,经PCR-SSCP法分析,42株 rpsL异常,47株rpoB异常,42株katG异常.结论大部分煤工尘肺结核患者的结核杆菌耐药分离株有基因突变,其突变率低于常规药敏试验结果.
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荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值
目的评价聚合酶链反应(PCR)荧光探针杂交技术(TaqMan技术)检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值.方法应用细菌学方法(涂片镜检和培养)及TaqMan法检测133份结核病患者痰标本,53份非结核呼吸系疾病患者痰标本.结果细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为36.1%,TaqMan法阳性率为61.7%,高于细菌学检测法,经统计学处理,两者有显著性差异(P＜0.05),用TaqMan法检测临床标本特异性为96.2%.结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点,是结核病辅助诊断的有效方法之一.
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双盲法痰检室间质控三年效果评价
目的探讨在结核病控制规程中痰涂片室间质控的新模式.方法以新登记肺结核病人痰涂片为质控重点,在区县级实验室之间,开展双盲初级室间质控,省级参比室进行终级质控考核.结果在不增加经费投入情况下,地区质控覆盖率可达100%,每年约50%新登记肺结核病人痰涂片置于质量监控之下.镜下阳性符合率从本课题实施前99.0%～100%下降至97.1%～98.3%,阴性符合率由99.4%～99.9%下降至98.5%～99.1%.结论采用双盲法开展同级间室间质控,是经济可行的一种间接督导方式,可有效地扩大质控范围和质控频率;两级双重室间质控使质量控制程序更趋严格,可切实发挥痰检质控在结核病控制规划中的作用.父
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大连市实施世行贷款项目以来耐药结核病流行趋势研究
目的观察1993～2000年结核分支杆菌的耐药率流行趋势.方法采用绝对浓度间接法对4种药物进行耐药测定.结果初始耐药率由1993～1994的34.6%下降至1999～2000年的18.2%,链霉素和异烟肼的初始耐药频率由1993～1994年的22.6%、13.2%下降至1999～2000年的13.4%、7.8%;复治耐药率由1993～1994年的52.1%下降至1999～2000年的35.7%.MDR的总耐药率1993～1994年为9.5%,1999～2000年的7.6%.结论大连市开展世行贷款项目以来初始及复治耐药率均呈下降趋势,但MDR的总耐药率未出现明显下降.
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BACTEC系统对依赖利福平结核分支杆菌生长与耐药性的分析
目的探讨依赖利福平结核分支杆菌(依R菌)在BACTEC系统中的生长特征,以便用该系统鉴定依R菌.方法选取L-J法初步鉴定的依R菌,制成菌液(10-4mg/ml)分别以0.1ml接种于含不同利福平(R)浓度(1～384μg/ml)的7H-12液体培养基中培养,用BACTEC法测定不同实验瓶生长指数(GI),判断耐药性,并对培养物称重及进行形态(抗酸染色)观察.结果 (1)耐药性,依R菌在R 1～96μg/ml 10个浓度中均耐药,R 192μg/ml临界,384μg/ml敏感.(2)菌体重量,R6、8、10、12、24μg/ml各瓶细菌重量(分别为87、125、116、104、65mg)明显高于对照瓶(35mg),重量比为1.9～3.6,平均2.9,其余各耐药瓶与对照瓶无明显差别.(3)培养物涂片抗酸染色,可见各R瓶内结核分支杆菌菌体比对照瓶粗大、染色质深、染色颗粒明显,以R 8μg/ml瓶为典型.结论依R菌在含R(6～24μg/ml)环境中生长旺盛,在无R环境中生长不良.
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郑州市1992～1996年结核分支杆菌原发耐药性观察
了解郑州市1992～1996年结核分支杆菌原发耐药性。方法采用绝对浓度法进行6种抗结核药物的耐受性测定。结果总原发耐药率、耐RFP率分别由1992年的41.5%、19.5%降至1996年的29.6%、11.1%。结论 1992～1996年郑州市结核分支杆菌原发耐药率和耐RFP率呈下降趋势。
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几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究
目的了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6(E)、MPT64(M)、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏(DTH)反应的能力.方法常规皮肤实验法:灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠,皮肤试验以生理盐水为阴性对照,5U PPD标准品为阳性对照,0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM分别于背部皮内注射,注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径(mm),取二者的平均值.皮肤试验轮圈法:生理盐水、5U PPD及0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧,每批6只,共3批.注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径(mm),取二者的平均值.结果常规皮肤试验0.8μgM、A、M+E及E+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异(P＞0.05),而0.8μgE抗原及M+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P＜0.05).时间效应:重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径(P＜0.05),24h测量效果较好.轮圈法皮肤试验排除个体差异后,结果与常规皮肤试验结果一致.结论从试验结果看,重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD.
关键词： 分支杆菌 结核 重组结核分支杆菌蛋白抗原 迟发超敏反应 -
利用发光自显影技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性
目的利用发光自显影技术建立一种快速、简便的结核分支杆菌利福平耐药性筛选方法.方法利用重组的分支杆菌噬菌体可在活菌内增殖的原理,来检测结核杆菌在含利福平液体培养基中的生长状况;采用发光自显影方法检测发光强度并确定活菌数,对43份结核杆菌样本进行快速检测,并与L-J培养基检测结果进行对比.结果发光自显影方法与L-J培养法相比,阳性率和真阴性率分别为95.7%、90%,佳检测的细菌浓度为107～108CFU/ml,佳药敏试验的利福平浓度为1mg/ml,利福平与结核分支杆菌孵育48小时后即可进行发光自显影分析.结论生物发光方法可用于快速筛选结核分支杆菌的利福平耐药性,是一种简单、快速、灵敏、实用的利福平药敏筛选方法.
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血清抗结核分支杆菌抗体对肺结核的疗效监测
目的研究血清抗结核分支杆菌抗体与肺结核病情变化的相关性,对肺结核疗效评价的实用价值.方法观察肺结核患者在进展期、吸收好转期、稳定期的血清抗结核分支杆菌抗体水平的变化情况.结果好转期、稳定期的抗结核分支杆菌抗体的阳性率(27.5%、19.5%)与进展期相比有显著差异(P<0.01).结核抗体阴转率为75.5%.结论血清抗结核分支杆菌抗体水平对评价肺结核的疗效有较高的实用价值.
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结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力
目的研究结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力.方法分别用生理盐水(A)、载体质粒(B)、卡介苗(C)和MPT64重组质粒(D)免疫小鼠,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体,免疫8周后以MTB腹腔内攻击小鼠,攻击4或9周后,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验.结果 D组10只小鼠中只有4只血清中检测出抗MPT64抗体.MTB攻击4周后,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它3组,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组,A组脾菌落数较其它3组明显增多,其余脏器菌落数各组无明显区别,A、B组可见肺部严重病变,C组未见明显病变,D组存在个体差异.MTB攻击9周后,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低,D组显著增高,各组肺、肝和脾重量无显著差别,C组肝菌落数明显低于其它3组,其余脏器各组间无显著差别,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变.所有鼠肝、脾均未见明显病变.结论 MTB MPT64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力,但比卡介苗差.
关键词： 抗原 MPT64 DNA疫苗 免疫 分支杆菌 结核 -
广东省肺结核临床分离菌株DNA指纹分析
目的构建结核分支杆菌IS6110 DNA指纹图谱,从分子水平探讨广东省结核分支杆菌的特征.方法参照Van Embden推荐的结核分支杆菌 DNA指纹标准方法,构建标准菌株Mt14323和广东省的74株临床分离株的以RFLP为基础的结核分支杆菌的IS6110 DNA指纹图谱;经互联网与世界结核菌DNA指纹库进行相似性比较;应用Gel compar 4.1(Applied Maths,Kortrijk,Belgium)软件对上述菌株的指纹图谱进行聚类分析.结果 Mt14323标准菌株和74例临床分离菌株IS6110DNA指纹图谱结果与国外同类报道一致;其中24.3%(18/74)的结核菌株的IS6110 DNA指纹相似值在1～0.65之间,鉴定结果为它们均是北京家族结核分支杆菌;IS61100 1个拷贝和2个拷贝菌株较多(21/74).结论目前"北京家族"结核分支杆菌菌株一定程度上在广东地区流行.
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Amplisensor-聚合酶反应定量检测脑脊液中结核分支杆菌DNA的研究
目的探讨Amplisensor-聚合酶反应(Amplisensor-PCR)定量检测脑脊液中结核分支杆菌DNA(TB-DNA)对结核性脑膜炎的诊断价值.方法采用Amplisensor-PCR对117例结核性脑膜炎患者及36例非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测,并与PCR(凝胶电泳后,经溴化乙锭染色)、涂片、培养法比较.结果 Amplisensor-PCR的敏感性显著高于涂片及培养,阳性率分别为57.13%、1.7%、6.7%(P＜0.001).结论 Amplisensor-PCR可以通过标准曲线划定检出下限,并可换算出标本中原始的靶DNA值,同时具有较高的特异性和敏感性,对结核性脑膜炎的诊断有一定的临床意义.
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DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较
目的了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值.方法应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株、耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况.结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中38株发生突变,突变率为92.7%(38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H37Rv株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在.与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为93.9%(62/66),敏感度为92.1%(35/38);特异度是96.4%(27/28).结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选.
关键词： DNA序列分析 聚合酶链反应-单链构象多态性 药物耐受性 分支杆菌 结核 -
复方PCR用于分支杆菌菌种鉴定的初步研究
目的寻找新的、快捷简便的分支杆菌菌种鉴定技术,进一步提高临床结核病诊断的水平.方法将3套分支杆菌基因组DNA的不同标记引物同时放入一个体系中,并在同一退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对已知标准株和部分临床株进行菌种鉴定.结果复方PCR方法可将结核复合群中的结核分支杆菌、牛结核分支杆菌与非结核分支杆菌一次性地区分开,特异性达到100%,灵敏度为10ng/反应.结论复方PCR技术是一种有效而又简捷的分支杆菌诊断方法,可用于临床上分结核与非结核分支杆菌或分支杆菌与非分支杆菌的初步区分.
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实验性大鼠结核病模型的特点
目的探讨感染了结核菌的Wistar大鼠的实验特点.方法用标准人型结核菌株H37Rv 0.01mg经尾静脉注入Wistar大鼠,6周后剖杀大鼠,观察肺、肝、脾组织大体病变及镜下特点,肺组织匀浆培养有无结核菌落生长.结果实验组大鼠肺组织可见明显的结核病变,感染成功率100%,肝、脾组织无结核病变.结论 Wistar大鼠对结核菌敏感,可作为结核病实验的动物模型.
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平菇双相培养基用于结核杆菌培养的研究
目的以平菇浸出液为基础成分,研制培养结核分支杆菌的一种新型双相培养基.方法经用H37Rv基础试验及对351份临床标本用酸性罗氏培养基对照.结果两种培养基总阳性数为172份(49%),其中平菇双相培养基166份(+),阳性检出率为47.3%.酸性罗氏培养基144份(+),阳性检出率为41.03%.分别占总阳性数的96.51%和83.72%,并且大多数结核杆菌在平菇双相培养基上的初生长时间明显快于酸性罗氏培养基时间.结论结果表明平菇双相培养基成分来源丰富,价格低廉,制作方便,操作简单,适合于我国广大基层医院和结核院所使用.
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γ-干扰素对免疫低下小鼠结核分支杆菌感染的影响
目的观察、评价γ-干扰素(IFN-γ)对免疫功能低下小鼠结核分支杆菌感染的影响和疗效.方法将DBA/2小鼠90只按免疫功能正常和免疫功能低下2种状态分别制成小鼠结核分支杆菌感染模型.随机分组给予IFN-γ或IFN-γ单克隆抗体治疗,检测肺组织菌落计数,观察治疗后生存率.结果免疫正常组小鼠无死亡,第2周、第4周菌落数分别为(51.5±17.5)×103 cfu/mL、(106.3±41.0)×103 cfu/mL.免疫低下组8只死亡,菌落数分别为(163.7±61.7)×103cfu/mL、(768.3±206.5)×103 cfu/mL,免疫低下+IFN-γ组3只死亡,菌落数分别为(54.2±21.3)×103cfu/mL、(212.7±80.7)×103 cfu/mL,免疫低下组与免疫低下+IFN-γ组比较有显著性差异.免疫正常小鼠给予IFN-γ抗体后肺组织菌落数增多,与对照组比较有显著性差异.结论IFN-γ增强宿主免疫功能,对结核分支杆菌感染小鼠产生保护效应,适用于免疫功能低下宿主合并结核感染的辅助治疗.
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肺结核病人痰涂片镜检不同质控方式效果评价
目的探讨适合我国各级实验室开展的痰涂片室间质量控制模式.方法设计了在不同地理条件下应用不同督导方式进行痰涂片镜检室间质控.结果及结论经培训后直接督导和间接督导之间、山区和平原之间复检痰片的各项符合率均无统计学差异.直接督导费用明显高于间接督导;山区督导费用明显高于平原(P<0.05).结合二种督导方式在各自实施中的特点,认为培训和室间质控是提高痰检质量的必要手段,在我国现阶段可根据各地区的疫情、结防力量、痰检水平和经费等实际情况,采取两种督导方式相结合、偏重其中一种模式进行痰涂片镜检质量控制.
