首页 > 文献资料
-
DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较
目的了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值.方法应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株、耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况.结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中38株发生突变,突变率为92.7%(38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H37Rv株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在.与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为93.9%(62/66),敏感度为92.1%(35/38);特异度是96.4%(27/28).结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选.
关键词： DNA序列分析 聚合酶链反应-单链构象多态性 药物耐受性 分支杆菌 结核 -
结核分支杆菌耐利福平耐药基因的检测
目的评估应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用PCR-SSCP方法对93株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株35株,耐RFP或含耐RFP耐多药株58株)和33例耐RFP肺结核病人痰标本rPOB基因突变进行检测,并对部分常规药敏试验耐药而用PCR-SSCP未检测到rPOB基因突变的PCR扩增产物阴性菌株用双脱氧末端终止法进行测序分析.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB基因PCR扩增产物258bp片段SSCP图谱正常;58株耐RFP分离株中,52株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为89.7%.SSCP图谱正常的5株耐RFP的PCR产物经测序证实,4株在531位密码子TCG→TTG,1株在526密码子CAC→TAC,1株未改变.33例耐RFP肺结核病人痰标本有30例PCR扩增阳性,23例SSCP图谱与H37RV株有差异,rPOB突变率为76.7%.结论 PCR-SSCP技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rPOB基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测.
-
不同地域株华支睾吸虫基因差异的研究
目的 探讨湖北、广东、辽宁和韩国4地华支睾吸虫的基因差异,为华支睾吸虫种下分型提供依据.方法 取湖北、广东两地的华支睾吸虫,提取基因组DNA,PCR特异性扩增18S rDNA V4区并测序;登陆GenBank,检索中国辽宁(AF217100)和韩国(AF408144)的华支睾吸虫18S rDNA的登录序列,应用系统发生学分析法对所有序列进行排列比较,分析4地华支睾吸虫的基因差异,并构建系统发生树,分析其亲缘关系.结果 获得的湖北和广东两地华支睾吸虫18S rDNA V4区的碱基数分别为392 bp和440 bp.通过对18S rDNA V4区基因序列的比较与进化树的构建,证实4个地域株华支睾吸虫的18S rDNA V4区具有较高的同源性(98%～100%),彼此间遗传距离较小(0～0.013);在系统发生树中,湖北株和广东株华支睾吸虫形成一个支系,韩国株和辽宁株华支睾吸虫形成另外一个支系.结论 以18S rDNA V4区为分子标记的DNA序列分析表明,湖北、广东、辽宁和韩国4地华支睾吸虫存在基因差异,但亲缘关系较近,即起源于共同的祖先.
-
华南地区HGV的流行状况和同源性分析
目的 了解华南地区庚型肝炎病毒(HGV) 的流行状况及HGV不同株和不同基因区的同源性. 方法 采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测来自广东、香港、云南的不同人群血清标本共1 991份.对其中20份的5端非编码区(5UTR) 238bp和3份非结构蛋白5区(NS5) 621bp进行了序列测定和同源性分析. 结果 一般人群HGV RNA阳性率为(0.73～1.34)%,献血员(2.52～2.90)%,静脉吸毒者17.86%,血液透析患者14.13%,接受骨髓移植者41.67%,在非甲～戊型肝炎病人为25.30%,肝细胞癌14.48%,乙型肝炎7.22%,丙型肝炎(8.33～16.13)%.不同株5UTR同源性介乎(90.40～100)%; 不同株NS5区核苷酸同源性(93.30～94.00)%,氨基酸为(97～99.2)%. 结论 接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者,乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是HGV的高感染人群.不同HGV株存在一定的地区性差异;同一地区不同人群的HGV株变异不明显;序列中存在高度保守区及较大变异区.
-
革兰阴性菌qnrA基因介导的喹诺酮耐药分子机制研究
目的 了解革兰阴性菌质粒介导qnrA耐药基因的发生率、分子遗传学背景及其阳性株的耐药谱.方法 收集2004年4月-2006年4月对萘啶酸耐药的临床分离无重复株共629株,采用特异引物PER结合测序进行qnrA阳性株的识别,表型确认试验结合PCR检测识别产ESBL或AmpC酶的qnrA阳性株,Kirby-Bauer法和E test法进行qnrA阳性株的药敏检测,质粒接合转移及Southern杂交检测进行qnrA基因的质粒定位,PCR策略克隆携带qnrA基因整合子基因结构并进行引物步移测序.结果 qnrA阳性株的总检出率为1.9%(12/629).菌种分布为肺炎克雷伯菌2.2%(3/138),阴沟肠杆菌17.1%(6/35),产气肠杆菌9.1%(1/11),枸橼酸杆菌属12.5%(1/8),沙门菌属14.3%(1/7).qnrA基因定位在80～180 kb大小质粒上的sul1型Ⅰ类整合子基因结构中.其中4株菌qnrA基因定位在整合子In37上,另外8株菌qnrA基因定位在一种新型的整合子InX上.所有qnrA阳性株均产ESBL,并具有可转移多重耐药的特征.结论 广东地区喹诺酮抗菌药耐药株中存在着质粒介导的耐药机制,但发生率较低;其耐药基因qnrA的水平传播能力有可能导致细菌耐药性的播散.
-
山东人群TTV感染状况及TTV山东株部分基因序列分析
1997-10 Nishizawa et al [1]发表了第一篇关于人类肝炎相关DNA病毒基因,暂命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)的论文,周育森et al [2]在国内首先测定了中国人TTV部分基因克隆序列.迄今国内少数实验室也相继开展了TTV感染的分子流行病学、临床和实验研究.初步研究结果表明,TTV感染同输血或血液制品密切相关,可能是导致肝功长期损害ALT异常又一重要致病因子.为探讨山东地区TTV感染存在和基因变异的情况及TTV在人类肝炎中作用和地位.我们以套式聚合酶链反应(nested-PCR)法,对输血后丙型肝炎和非甲～庚型肝炎患者进行TTV检测,并对部分病例进行序列分析,现将结果报告如下.
-
中国法乐四联症患儿HEY2基因突变筛查的初步研究
目的 探讨中国法乐四联症患儿HEY2基因突变的情况.方法 应用递减聚合酶链反应方法及DNA测序技术,对我院52例非综合征型法乐四联症患儿及50例健康人HEY2基因5个外显子及其侧翼序列进行直接测序,并分析HEY2基因突变的情况.结果 在HEY2基因的全部5个外显子中,未发现可引起氨基酸序列改变的突变位点,但我们发现了2个新的杂合性突变位点:1例患者的eDNA 621位碱基为A→T杂合性突变,3例患者及3例健康对照的eDNA222位碱基存在一个T→G杂合性突变,但上述两个突变均为同义突变,不影响蛋白质序列.结论 HEY2基因可能不是中国法乐四联症发病的相关基因.
-
产超广谱β内酰胺酶临床分离株可转移多重耐药分子机制的研究
目的研究产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)临床分离株可转移多重耐药性的分子机制. 方法采用E-试验条进行药敏检测,电转化试验筛选、分离耐药质粒,聚合酶链反应(PCR)扩增Ⅰ型整合子基因盒插入序列及其分子克隆和序列分析. 结果 9个产ESBLs耐药质粒中有8个检测出了插入序列,其中7个携带了1～2种抗药性基因盒.包括氨基糖苷类钝化酶aacA4、aadA2和 aadA5;甲氧苄啶钝化酶dhfrA12和dfrA17;利福平钝化酶arr-3;氯霉素外排蛋白cmlA6.基因盒功能与转化子耐药表型一致. 结论质粒定位和整合子介导的抗药性基因盒可能是导致ESBLs产酶株多重耐药性产生和(或)播散的重要原因.
-
乳腺癌细胞周期调定点激酶基因突变的研究
目的 研究细胞周期调定点激酶基因(CHEK2基因)突变与乳腺癌的关系.方法 取65例乳腺癌组织标本作实验组,21例乳腺良性疾病组织和145例正常人血液标本作正常对照.全部标本以酚-氯仿抽提法提取DNA 后经PCR扩增CHEK2基因外显子1、10、11、13、14,并分别对PCR扩增产物进行SSCP分析,然后对出现泳动变位或异常区带者进行DNA测序,后与基因库序列对比分析其突变情况.结果 65例乳腺癌共检测出4例突变, 1例为外显子10缺失所致框移突变(1100del C),3例为外显子11的插入所致框移突变(1336ins G);145例正常人检测出1例突变,为外显子1的错义突变(252A>G);21例良性疾病患者未发现突变.所有检测对象未发现CHEK2基因外显子13、14有突变.乳腺癌组CHEK2基因突变率为6.15%(4/65),与对照组比较(0.6%,1/166)差别具有显著性(P<0.05).结论 CHEK2基因突变与乳腺癌发生有一定关系,可能在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用.
关键词： 乳腺癌 细胞周期调定点激酶基因 SSCP DNA序列分析 -
一种新型β-内酰胺酶SHV-59的发现
目的鉴定来自新生儿病房血液培养的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的β-内酰胺酶SHV基因. 方法应用PCR技术对分离自新生儿病房血培养样本的5株产ESBLs肺炎克雷伯菌进行SHV基因扩增,利用ABI 377自动荧光测序仪对PCR扩增产物进行测序,并采用琼脂稀释法测定11种抗菌药物对产酶菌的低抑菌浓度(MIC). 结果 5株肺炎克雷伯菌SHV基因PCR扩增均阳性,DNA序列分析证实其中4株为SHV-12型,另外1株产一种新SHV型β-内酰胺酶,该酶与SHV-1比较显示2个氨基酸位点突变,分别为丙氨酸(Ala)134→缬氨酸(Val)和脯氨酸(Pro)269→亮氨酸(Leu),新型β-内酰胺酶经确认并命名为SHV-59(GenBank注册号:AT790341). 结论本院发现一新型β-内酰胺酶SHV-59.
-
X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例
2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G＞A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.
-
血管内皮生长因子部分多肽抗血管生成的研究
目的观察血管内皮生长因子(VEGF)部分多肽(3-4外显子)抗血管生成的作用.方法抽提LoVo细胞总RNA,进行RT-PCR,克隆VEGF部分多肽cDNA,构建VEGF部分多肽原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物.表达产物经亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 和鸡胚尿囊膜(CAM)血管测定其生物学活性.结果表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中,具有良好的抗原性和特异性,并具有抑制HUVEC增殖及CAM血管形成的活性.结论 VEGF部分多肽具有竞争抑制血管生成的功能,在肿瘤生物靶向治疗中具有一定潜在价值.
-
中国先天性心脏病Nkx2.5基因突变筛查及关联研究
目的探讨Nkx2 5基因突变和单核苷酸多态性(SNPs)与中国先天性心脏病(CHD)患儿的相关性.方法应用聚合酶链反应结合DNA测序技术,对110例CHD患儿及110例正常对照者的Nkx2.5基因外显子1及其侧翼进行突变检测,并对其SNP进行基因分型,分析单个位点的等位基因和基因型频率是否与CHD有关.结果在Nkx2.5基因外显子1中,CHD组及对照组均未发现有任何突变位点,仅在CHD组找到1个新的SNPs;这个新的SNPs位于上游63碱基,其基因型频率在VSD组及TOF组和对照组之间的分布差异有统计学意义(x2=34.021,df=2,P＜0.01;x2=15.233,df=2,P＜0.01),等位基因频率在VSD组及TOF组和对照组之间的分布差异亦有统计学意义(x2=24.813,df=1,P＜0.01;x2=7.146,df=1,P＜0.01).结论Nkx2 5基因突变与中国先天性心脏病之间无相关,Nkx2.5基因上的SNP与中国先天性心脏病中室间隔缺损和法洛四联症之间存在显著的相关性.
-
一个遗传性血管水肿家系C1抑制物基因突变的检测分析
目的对一个遗传性血管水肿(HAE)家系患者C1抑制物(C1 INH)基因的突变类型进行检测分析.方法用聚合酶链反应扩增产物直接测序法检测HAE患者C1 INH基因8个外显子及旁侧内含子序列,将检测结果与GenBank公布的C1 INH基因序列相比较,确定突变.为除外多态性可能,在30名正常人中对该突变进行分析.结果该家系中的5例患者外显子8中均检测到1种新的突变类型(核苷酸序列17839 del C),正常人中无此改变.结论在该家系中发现C1 INH基因核苷酸序列17839 del C突变,该突变可能是此家系发病的分子基础.
-
霍乱弧菌及其它致病弧菌分子遗传特征和DNA多态性研究
目的探讨霍乱弧菌和其它致病弧菌分子遗传特征及相互关系.方法用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction; PCR)、DNA 序列分析、随机扩增多态性 DNA (Randomly amplified polymorphic DNA; RAPD)和平均链锁聚类分析,对3株O139群霍乱弧菌、3株O1群 El Tor型、4株古典型和3株副溶血等致病弧菌进行检测.结果 O139群霍乱弧菌和O1群含有相同的霍乱肠毒素(CTX)A2-B亚单位基因, 核苷酸序列同源性为97.1%-98.9%.RAPD 将不同弧菌分成4类;即①O139群和El Tor型、②古典型、③副溶血和创伤弧菌及④河弧菌.O139群与O1群El Tor型DNA指纹图谱几乎完全一致,平均链锁距离为0,与古典型相似,平均链锁距离为2.07. 与副溶血等致病弧菌差别较大,平均链锁距离为6.76-8.54.结论 O139群霍乱弧菌与O1群El Tor型遗传特征相同,前者很可能由El Tor型进化而来.副溶血与创伤弧菌也具有相同遗传特征.霍乱弧菌和其它致病弧菌遗传特征表现出多态性.
关键词： 霍乱弧菌 聚合酶链反应 DNA序列分析 随机扩增多态性DNA 平均链锁聚类分析 -
登革4型病毒广东流行株NS2a-NS2b基因序列分析
目的分析登革4型病毒(DV4)广东株的基因序列,比较其同源性,追查DV4的地理来源.方法RT-PCR扩增DV4 NS2a-NS2b基因片段,克隆至PGEM T载体,分析其序列.结果1990年分离的4个毒株在所分析的区段具有相同的序列,与DV4H241、814669株、1978年广东株(GD7856B2)和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是97%(98%)、94%(96%)、93%(98%)和99%(98%).GD7856B2株与DV4H241、814669株和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是93%(98%)、96%(97%)和98%(93%).结论1990年引起广东省登革热流行的毒株很可能只有1个,1990年的毒株与1978年的毒株可能来自不同的疫源地.
关键词： 登革病毒 逆转录/聚合酶链反应 DNA序列分析 同源性 -
中国汉族人血小板反应素蛋白1基因单核苷酸多态性与冠心病的关联研究
目的 探讨血小板反应素蛋白1(TSP-1)基因第13外显子单核苷酸多态性(SNPs),致TSP-1蛋白第700位氨基酸丝氨酸转换为天冬氨酸(700N→S)与中国汉族人冠心病有无相关性.方法 应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性技术(PCR-RFLP),筛查南京医科大学第一附属医院和上海中医药大学附属岳阳医院2003年11月至2007年5月437例汉族冠心病患者和对照组423例TSP-1基因第13外显子钙,结合活性片段8831A→G,对筛查到含有突变的片段进行序列测定,并与正常序列进行对照分析.结果 2组均以AA型为主,测序仅检测到AG杂合型19例,未检测到GG纯合子.在2组中AG杂合型所占比例比较差异无统计学意义(2.5%比1.9%,P＞0.05).TSP-1基因8831A→G在中国汉族人中发生频率低,与汉族人冠心病发生无相关性(AG对AA:OR=1.699;95%CI 0.309～9.348,P＞0.05).结论 TSP-1基因8831A→G不是中国汉族人冠心痛发生的独立危险因素.
-
应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断
血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷引起的X-连锁隐性遗传出血性疾病,在男性中的发病率约为1/30 000,散发率可达患者总数的30%～50%~[1].由于目前还不能根治,对于携带者和高危胎儿进行基冈诊断非常必要.连锁分析和DNA序列分析是单基因遗传病有效的基因诊断方法.
-
食管鳞状细胞癌p16基因变异分析
目的:通过对p16基因变异在ESCC中的临床病理意义的研究,为ESCC的临床防治提供可靠指标.方法:采用PCR-SSCP及DNA序列分析,检测69例ESCC的p16基因第一、二外显子突变.结果:69例ESCC中p16基因变异者33例(M组)与未变异者36例(N组)在淋巴结转移率和远处转移率方面差异有显著性(P＜0.05),两组在患者年龄、性别、肿瘤长度和浸润深度方面差异无显著性(P＞0.05).结论:p16基因的变异可能是ESCC的晚期变化,它可作为判断ESCC恶性程度、发展及预后的一个重要指标,并且也为筛选高危临床病例提供客观依据.
-
非小细胞肺癌患者血清O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因异常甲基化检测及其临床意义
目的 探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清中O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyhransferase,MGMT)基因启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义.方法 基因测序法检测62例NSCLC患者、30例肺部良性疾病患者和16例健康体检者血清中MGMT基因启动子区域甲基化状况,并分析其与临床特征的关系.结果 NSCLC患者血清MGMT基因甲基化检出率为27.42%(17/62),而肺部良性疾病患者和健康体检者血清未检出MGMT基因甲基化(Fisher精确概率法,P＜0.01).MGMT基因甲基化检出率与NSCLC患者年龄、性别、病理类型、分化程度无明显相关,但在晚期患者中检出率较高(P＜0.05).MGMT基因甲基化患者吸烟指数(年·支)明显高于非甲基化患者(P＜0.01).结论 MGMT基因异常甲基化可能在NSCLC发生、发展中起重要作用,有望成为NSCLC辅助诊断的分子标记.
