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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达
目的在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6和CFP-10,获得纯化的重组ESAT6-CFP10(rCFP10-ESAT6)融合蛋白抗原.方法通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)扩增CFP10-ESAT6融合基因;以质粒pET-28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Western blotting) 鉴定rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中的表达,确定rCFP10-ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式;采用Chelating Sepharose Fast Flow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白.Western blotting及酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组蛋白的免疫原性.结果重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性形式表达;分子量约28kDa,表达量约占菌体总蛋白的46%,纯化后的rCFP10-ESAT6样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%左右,每100 ml培养菌可获得16 mg左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应.ELISA结果分析表明,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清.结论成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,该重组蛋白具有特异的免疫原性.
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以ESAT-6、CFP-10为基础的ELISPOT试验、血清TB-SA抗体检测、PPD试验在肺结核诊断中应用价值研究
免疫学技术是结核分枝杆菌感染的重要诊断方法.血清结核抗体的检测已作为结核病诊断辅助指标之一[1],TB-SA(tuberculosis-specific antigen)抗体检测在肺结核诊断中具有较高的敏感性和特异性[2];PPD皮肤试验已被卫生部生物制品标化委员会规定可临床诊断的参考指标嘲;近年来以结核菌特异蛋白ESAT-6(6 KD early secretory antigenic target)、CFP-10(culture filtrate protein 10)为基础的酶联免疫斑点试验(ELISPOT TEST)在结核感染诊断中的应用价值已被许多相关研究所证实[4-6],本研究旨在评价3种试验在肺结核诊断中的应用价值.
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结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6的研究进展及应用
目前,结核病已是传染病的头号杀手.全世界近1/3的人感染Mtb,而且每年约有900万新发临床结核病患者及200～300万死亡患者.随着多耐药Mtb和HIV与Mtb双重感染的发生率增加,迫切需要研制新的疫苗和抗结核药物,以及可靠的早期诊断方法.Mtb早期分泌抗原靶6(6 kDa early secreted antigenic target protein,ESAT-6)是结核病疫苗和结核病诊断试剂的候选蛋白质之一.现对ES-AT-6的基础研究概况及应用综述如下.
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结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
目的 构建结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用.方法 用PCR技术特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-ESAT-6.用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109b中,经表型筛选检测其自激活作用.结果 获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-ESAT-6.结论 ESAT-6无自激活作用,可用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子.
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ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用
为了评价ELISPOT试验在儿童结核病诊断中的应用价值,采用以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT-6和CFP-10(culture filtrate protein-10)为抗原的ELISPOT试验技术,检测了42例非结核性肺疾病患儿和27例活动性结核病患儿体内特异性T淋巴细胞分泌的γ-干扰素水平,评价其在儿童活动性结核病和潜伏结核感染中的敏感性和特异性,并将结果与结核菌素皮试结果(PPD)进行比较;同时分析了该试验的各影响因素.结果显示,ELISPOT试验的敏感性为88.9%,特异性(97.6%)高于PPD(81%,P﹤0.05);与PPD试验结果结合分析,其诊断阳性率为96.3%.此外,ELISPOT试验结果与性别、年龄、BCG接种史、结核病接触史、机体免疫状态、PPD直径和感染部位等影响因素之间的相关性进行了初步探讨.实验结果提示ELISPOT试验适宜作为儿童PPD试验初筛后结核病诊断的重要辅助工具.
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分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗在小鼠体内的免疫效应
目的 研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应.方法 以2×106 CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD8+ T细胞亚群百分比;TB-PPD刺激后以MTT法测定淋巴细胞增殖程度,ELISA检测诱生IFN-γ和IL-10水平.结果 rBCG和BCG免疫组小鼠血清特异性抗体滴度分别达1∶5 120和1∶2 560,差异有统计学意义(q=3.89,P=0.034).rBCG组的IFN-γ水平在第8周达高(597.1 pg/ml),同期BCG组为416.7 pg/ml,差异有统计学意义(q=10.60,P<0.01).rBCG组IL-10水平第4周和第6周时也高于BCG组(P<0.05),第8周回落.除第6周外,rBCG组的淋巴细胞增殖指数都高于BCG组(P<0.05).第8周rBCG组和BCG组CD4+T亚群分别占(71.1±2.6)%和(62.3±2.0)%,差异有统计学意义(q=4.16,P=0.026);CD8+T亚群分别占(35.9±1.7)%和(26.9±2.8)%,差异有统计学意义(q=4.52,P=0.019).结论 融合蛋白Ag85B-ESAT-6引入BCG增强了其抗MTB反应.
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重组沙门菌表达结核分枝杆菌ESAT-6及其特异性免疫应答分析
目的 分析重组沙门菌表达的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌性蛋白ESAT-6诱导的特异性免疫应答.方法 将ESAT-6蛋白编码基因导入原核表达载体pYA3333中,构建重组质粒pYA33-esat.通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,获得重组菌X4550(33-esat).以每只105CFU剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL/6小鼠,间隔18 d,在第2次免疫后10 d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)及派伊尔淋巴集结(Peyer's patch,PP)细胞,以ESAT-6多肽作为刺激原,检测特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞.同时,运用CFSE方法榆测了体内抗原特异性CTL效应.结果 经沙门菌表达并运送的Mtb抗原ESAT-6能诱导特异性的免疫应答.在肺脏及PP细胞巾,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主.而在脾脏和MLN中,免疫应答呈现Th1/Th2混合应答.此外,体内CTL试验表明,重组菌能够诱导抗原特异的CTL效应,且特异性杀伤率为69.9%.结论 以滴鼻方式接种重组沙门菌,不仅能够诱导ESAT-6蛋白特异性的细胞免疫应答,还能激发特异的CTL效应,为结核病的防控提供了新的认识.
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结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究
目的 构建表达结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用.方法 采用SOE法构建CFP-10/ESAT-6融合基因,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10/ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平.结果 经DNA测序证实CFP-10/ESAT-6融合基因序列正确.重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶.结论 表达CFP-10/ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考.
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结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析
目的 通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础.方法 体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,SELEX技术筛选获得ESAT-6的适体库,将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,找出高亲和性适体.结果 经过13轮筛选,ssDNA文库与ESAT-6亲和力从0.257提高到1.163,且12轮后A值趋于平衡,克隆、测序获得ESAT-6的高亲和性适体,其中适体A10亲和力高,达到1.515,且与CFP10-ESAT6融合蛋白无交叉反应.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与ESAT-6结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了ESAT-6的高亲和性适体.
关键词： 分枝杆菌 结核 ESAT-6 指数级富集配体的系统进化技术 适体 -
结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85与ESAT-6在肾结核感染诊断中的应用分析
目的：探讨结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85复合体（Ag85）与早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）在肾结核感染诊断中的意义，为临床诊断肾结核提供有效的方法。方法选取就诊经病理诊断为肾结核患者31例作为肾结核组，原发性肾小球肾炎患者30例为非肾结核组，经检查患者无结核病史、结核菌素试验以及血结核抗体均为阴性；用免疫组化的方法检测Ag85、ESAT-6在肾组织中的表达。结果肾结核组的切片发现有棕黄色、褐色阳性物质沉积，而在非肾结核组的切片中，仅在4例切片中见到浅褐色的物质沉积于肾间质；而通过检测两组切片中Ag85、ESAT-6的光密度值，发现肾结核组中的Ag85、ESAT-6的光密度值显著高于非肾结核组，差异有统计学意义；肾结核患者中Ag85的表达与ESAT-6的表达呈正相关，另外，Ag85、ESAT-6这两种抗原对肾结核分枝杆菌的敏感度均较高达100．0％，而ESAT-6对肾结核的特异度较 Ag85更高，差异有统计学意义。结论 Ag85、ESAT-6在肾结核患者肾组织中的表达增强，可作为检测肾结核的补充诊断指标。
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ELISA法检测浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值
目的 探讨酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测浓缩脑脊液结核分枝杆菌早期分泌性抗原6000(6000 early secretory antigenic target,ESAT-6)对结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的诊断价值.方法 采用腰椎穿刺抽取106份脑脊液,其中49份来自TBM患者,57份来自非TBM患者.应用Amicon Ultra-4超滤离心管离心浓缩脑脊液.采用ELISA法检测脑脊液中ESAT-6含量.结果 浓缩脑脊液ESAT-6抗原检出敏感性显著高于脑脊液原液的检出率(87.50％比67.35％,P＜0.05),而其特异性与脑脊液原液比较无统计学差异(92.16％比96.49％,P＞0.05).结论 应用离心超滤技术浓缩脑脊液能显著提高ELISA法检测脑脊液ESAT-6抗原的检出率,提高TBM的诊断率.
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用
[目的]研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)分泌蛋白ESAT-6(early secreted antigenic target of6 kD)对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理.[方法]应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况.[结果]RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系(P＜ 0.05);RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系(P＜0.01).10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果.稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml.[结论]胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡.
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早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6
目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值.方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6.结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%.结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法.
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ESAT-6对人外周血γδT细胞IL-17的影响及其信号通路的研究
目的:观察ESAT-6对人外周血γδT细胞表达IL-17的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨.方法:用Ficoll密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞,培养3天后用流式细胞仪分离纯化γδT细胞,并用唑来磷酸及IL-2刺激扩增γδT细胞,12天后用ESAT-6刺激γδT细胞,并给予信号传导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂S3I-201,设置未加入ESAT-6及不加任何抑制剂的对照组,用PCR法检测IL-17、STAT-3的基因转录水平,用ELISA法检测细胞培养液中IL-17的含量,用Western blot检测STAT3蛋白的表达.结果:ESAT-6能显著提高STAT3及IL-17的基因转录及蛋白表达(P<0.01),且S3I-201能显著抑制ESAT-6所致的γδT细胞IL-17mRNA的转录及淋巴因子的增加(P<0.01).结论:ESAT-6能提高外周血γδT细胞IL-17、STAT3的转录及表达,ESAT-6增强γδT细胞IL-17表达的机制可能与STAT3信号通路有关.
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B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究
目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应.方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果.结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21.于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应.结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应.
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分枝杆菌ESAT-6研究进展
ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原性靶,是从结核杆菌短期培养滤液(ST-CF)中纯化分离出的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用;由于编码ESAT-6的基因在卡介苗(BCG)各菌株中缺乏,ESAT-6可望成为人和动物结核病的特异性诊断试剂、抗结核亚单位疫苗的组分和DNA疫苗的候选目的抗原.
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活动期结核病患者外周血NK细胞免疫反应特征分析
为了探讨自然杀伤(nature killer,NK)细胞在抗结核免疫应答中的特征,我们表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT-6,体外刺激结核病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC),采用流式细胞术分析不同亚群NK细胞IFN-γ释放,并与T细胞释放IFN-γ水平进行相关性分析.结果显示,经结核特异性抗原ESAT-6刺激后,结核患者来源的PBMC中有2.80％±0.65％的NK细胞可以释放IFN γ,而正常人NK细胞释放的比例仅为0.09％±0.01％,两者间有显著差异(P＜0.001);同时CD56highCD16dim NK亚群细胞分泌IFN-γ的水平(6.50％±0.94％)显著高于CD56dimCD16high NK亚群细胞(1.78％±0.38％);比较同一抗原刺激条件下T细胞释放IFN-γ的能力,显示NK细胞释放IFN-γ的能力高于CD4+T和CD8+T细胞,并与释放IFN-γ的CD4+T细胞的比例呈显著正相关.上述研究结果表明,NK细胞在结核特异性抗原ESAT-6刺激下可通过分泌高水平的IFN-γ协同CD41 T细胞在抗结核感染中发挥重要作用,增强NK细胞的功能,以提高结核病患者的免疫应答水平,将为结核病的治疗提供新的策略.
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表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗的构建及其活性鉴定
为构建膜表达糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的结核杆菌早期分泌靶抗原6 kD(ESAT-6 )和分泌IL-21的B16F10瘤苗并鉴定其活性,利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒,以脂质体转染重组质粒到B16F10细胞,G418筛选出阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光、FCM和Western blot检测瘤苗细胞靶抗原表达,用瘤苗细胞培养上清刺激小鼠CD8+ T细胞,检测瘤苗所分泌IL-21的生物学活性.结果表明,pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒DNA测序正确,B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗细胞目的基因ESAT-6表达于瘤苗细胞表面,增殖能力未受外源基因导入影响,分泌的IL-21具有生物学活性,为研究膜表达ESAT-6和分泌表达IL-21瘤苗的抗瘤效应奠定了基础.
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结核分枝杆菌rdES AT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究
目的：构建结核分枝杆菌（MTB）融合基因2×esat-6原核表达载体，利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体（rdESAT-6），Western blot分析其抗原性，并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因，构建pMF41-2×esat-6原核表达载体，电转化耻垢分枝杆菌，诱导表达rdESAT-6蛋白，Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和结核斑点金免疫渗滤试验（TB-DOT）检测血清结核抗体，评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒，以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白，纯化的蛋白纯度在95％以上，可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明，rdESAT-6蛋白在MTB 阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79．75％（63/79）、61．70％（29/47），好于TB-DOT的62．03％（49/79）、44．68％（21/47）（P＜0．05）。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95．24％（40/42）。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性，可作为结核病血清学诊断的优选抗原。
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结核抗原ESAT-6基因的克隆及在大肠埃希菌中的表达
目的将结核分支杆菌ESAT抗原编码区基因克隆,并使其在大肠埃希菌中表达.方法培养并抽提结核分支杆菌基因组,采用聚合酶链反应(PCR)扩增编码ESAT的全长cDNA,并插入到原核表达载体pGEX5T中,构建pGEX5T-ESAT重组质粒.IPTG诱导使该基因在k802菌中表达,并用免疫印迹(Western blot)方法确证表达蛋白的特异性.结果 PCR扩增获得了单一的条带,大小约0.3 kb;全自动测序与Genbank中登录的序列完全相同.获得了pGEX5T-ESAT重组子并在k802菌中表达,该蛋白可被结核病患者血清特异地识别.结论扩增和克隆了结核杆菌ESAT抗原的全长cDNA并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础.
