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ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用
为了评价ELISPOT试验在儿童结核病诊断中的应用价值,采用以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT-6和CFP-10(culture filtrate protein-10)为抗原的ELISPOT试验技术,检测了42例非结核性肺疾病患儿和27例活动性结核病患儿体内特异性T淋巴细胞分泌的γ-干扰素水平,评价其在儿童活动性结核病和潜伏结核感染中的敏感性和特异性,并将结果与结核菌素皮试结果(PPD)进行比较;同时分析了该试验的各影响因素.结果显示,ELISPOT试验的敏感性为88.9%,特异性(97.6%)高于PPD(81%,P﹤0.05);与PPD试验结果结合分析,其诊断阳性率为96.3%.此外,ELISPOT试验结果与性别、年龄、BCG接种史、结核病接触史、机体免疫状态、PPD直径和感染部位等影响因素之间的相关性进行了初步探讨.实验结果提示ELISPOT试验适宜作为儿童PPD试验初筛后结核病诊断的重要辅助工具.
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T-SPOT.TB在肺结节病与肺结核鉴别诊断中的应用价值
目的 通过T-SPOT.TB检测,探讨其在肺结节病和肺结核鉴别诊断中的应用价值.方法 检测2008年1月至201 1年3月在北京协和医院确诊的44例肺结节病和30例肺结核患者并进行对比.结果 44例肺结节病患者T-SPOT.TB阳性12例(27.3％),30例肺结核患者阳性27例(90％);肺结节病患者ESAT-6和CFP-10肽段合并的分泌IFN-γ细胞频数是46 SFCs/106PBMC(IQR 28 ～ 204),显著低于肺结核患者565 SFCs/106pBMC(IQR 170～2340).结论 T-SPOT.TB检测有助于鉴别诊断肺结节病与肺结核.
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自体EBV-LCL及同种异体单核细胞在ELISPOT试验中的抗原递呈作用研究
目的 探索自体EB病毒(EBV)转化的B淋巴母细胞系(EBV-LCL)细胞及同种异体单核细胞在ELISPOT试验中的抗原递呈功能.方法 采用Ficoll分离PBMC,采用CD14磁珠分选CD14单核细胞;采用序列特异性引物PCR扩增HLA等位基因特异性片段,进行HLA分型;复苏冻存的表位特异性的T细胞克隆细胞及相应的自体EBV-LCL细胞,采用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测自体EBV-LCL细胞及具有表位相关HLA分子的同种异体单核细胞的抗原递呈功能.结果 表位特异性的T细胞克隆细胞能够识别由自体EBV-LCL细胞及具有表位相关HLA分子的同种异体单核细胞递呈的抗原肽并分泌IFN-γ.EBV-LCL细胞与单核细胞的抗原递呈能力无明显区别.表位特异性T细胞克隆细胞冻存复苏后其IFN-γ产生细胞的比率小于10％.结论 自体EBV-LCL细胞及具有表位相关HLA分子的同种异体单核细胞在ELISPOT试验中能发挥抗原递呈功能.
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广西地区三类人群EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫状态的研究
目的 初步探讨广西地区鼻咽癌患者、血清VCA/IgA阳性高危人群及血清VCA/IgA阴性健康人群EB病毒LMP2特异性细胞免疫状态的差异.方法 选择广西苍梧地区经血清学筛查VCA/IgA阳性高危人群志愿者60例,对照为血清VCA/IgA筛查阴性的健康志愿者20例,同时选取广西壮族自治区人民医院经病理确诊鼻咽癌患者134例,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测外周血中LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫水平.比较鼻咽癌患者与健康志愿者、高危人群外周血LMP2特异性CTL免疫状态的差异.结果 鼻咽癌患者LMP2特异性CTL免疫水平明显低于健康志愿者及血清EB病毒抗体阳性人群,差异有统计学意义(P＜0.01);血清EB病毒抗体阳性三种不同滴度人群间LMP2特异性T细胞免疫反应差异有统计学意义(P=0.002);鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者同Ⅲ期及Ⅳ期患者的LMP2特异性T细胞免疫反应存在差异(P＜0.01).结论 三类人群间LMP2特异性CTL水平的差异可能是导致EB病毒长期潜伏感染并导致鼻咽癌发生的重要原因,针对LMP2的特异性免疫治疗有望降低鼻咽癌的发生率.
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HIV-1膜抗原部分糖基化位点改造对免疫原性及假病毒形成的影响
目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定糖基化位点改造对Env免疫原性及功能性假病毒形成能力的影响.方法 采用环形诱变,DpnⅠ筛选的方法对Env进行定点突变,单周期感染试验检测功能性假病毒形成能力,免疫小鼠,利用假病毒中和试验与ELISPOT分别检测突变对中和抗体和T细胞分泌Env特异的IFN-γ的影响.结果 N197Q突变体使Env诱导中和抗体的能力提高而诱导T细胞分泌Env特异的IFN-γ的能力降低,并使Env不能形成功能性假病毒;G2突变体(N624Q,N637Q)诱导的中和抗体能更好地中和假病毒74-2,仉中和假病毒Wt的能力下降,对Env诱导T细胞分泌Env特异的IFN-γ的能力和功能性假病毒形成无明显影响.结论 特定糖基化位点的改造影响假病毒的形成及Env的免疫原性.
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细胞免疫和遗传因素对乙型肝炎疫苗阻断母婴传播效果的影响
目的 比较接种重组乙肝疫苗后不同体液免疫应答高危儿童的细胞免疫反应特点,进一步探讨母婴阻断失败、无应答的机理.方法 124名母亲HBsAg和HBeAg双阳性的新生儿按常规乙肝的免疫程序接种重组CHO和酵母乙肝疫苗,于第1针免后3、7、12月检测HBsAg和抗-HBs,判定免疫成功或失败的新生儿,首针后60～120月(平均80月)再次检测HBsAg和抗-HBs指标,选取8名免疫重组乙肝疫苗母婴阻断失败儿童、4名免后无应答抗体反应的儿童和11名母婴阻断成功的儿童采集静脉血样,分离淋巴细胞,应用ELISPOT方法检测产生IL-2斑点形成细胞的数量,并对斑点数和表面抗体滴度的相关性进行比较,同时分析HLA-A、-B、DRB1和DQB1等位基因的多态性.结果 (1)124名研究对象中有77.4%的儿童可产生保护性表面抗体,成功阻断母婴传播;13.7%的人免疫失败,感染乙肝;8.9%的儿童则对乙肝疫苗呈无应答状态.(2)免疫成功组产生IL-2细胞数(55.2±42.22)显著高于免疫失败组(3.75±3.24)和抗体无应答组(6.75±3.59),P＜0.01.(3)儿童免疫乙肝疫苗后的表面抗体滴度与经乙肝疫苗诱导产生的特异性分泌IL-2的T细胞数量呈显著性正相关(r=0.601,P＜0.01).(4)HLA-B*48在对酵母乙肝疫苗无应答的儿童中占有25%的频率,显著高于免疫成功(2.2%)和失败的儿童(0%),P＜0.05.对CHO疫苗无应答儿童的HLA-DRB1*15的频率显著高于免疫成功和失败的儿童(P＜0.05).结论 乙肝疫苗母婴阻断失败和免后抗体无应答儿童的细胞免疫应答显著低于阻断成功的儿童,并且可能与遗传因素有关.
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T淋巴细胞亚群和病毒感染
细胞免疫功能在人体抗病毒感染中发挥重要作用,各种病毒感染性疾病的转归与细胞免疫功能尤其是与T淋巴细胞功能密切相关.临床上目前缺乏体内直接检测T淋巴细胞功能的手段,主要靠体外间接的方法来评估.如检测外周血中T淋巴细胞及各亚群数量和比例、增殖功能及产生细胞因子的能力,主要方法有ELISA、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、流式细胞术(FCM),其中FCM鉴于其独特的优势在临床中应用广泛.
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建立结核分枝杆菌抗原K6 IFN-γ ELISPOT用于结核病辅助诊断
目的:建立结核分枝杆菌抗原K6作为刺激源的IFN-γ ELISPOT检测方法,并初步评价该方法用于结核病辅助诊断价值.方法:结核病患者和非结核性肺部相关疾病患者外周血单核细胞(PBMC)分别加入预包被ELISPOT板对应孔,分别加入抗原K6、T-SPOT.TB试剂盒抗原A和B,每个PBMC样品设阴性对照孔和阳性质控孔.37℃、5％ CO2培养20 ～ 24小时,弃细胞,依次加入酶标检测抗体、底物显色获得斑点.ELISPOT读板仪进行斑点计数和分析.结果:K6和T-SPOT.TB试剂盒检测敏感度分别为80.0％和85.9％、特异度分别为83.9％和73.2％,两者比较差异均无统计学意义.K6作为刺激原的IFN-γ ELISPOT诊断结核病阳性预示值为88.3％,阴性预示值为73.4％.结核病组,抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的细胞斑点数(SFC)平均值分别高于抗原A和K6(P=0.011和P=0.004),抗原A和K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC平均值比较差异无统计学意义(P＞0.05).非结核性肺部相关疾病组,抗原A、抗原B和K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC平均值两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:K6可作为结核病IFN-γELISPOT诊断候选抗原之一.
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检测NDV诱导特异性细胞免疫的ELISPOT试验方法建立
目的:建立检测新城疫病毒(NDV)诱导特异性细胞免疫的ELISPOT试验方法,实时分析NDV免疫鼠的IFN-γ水平.方法:用NDV单克隆抗体包被96孔混纤板,在反应孔中加入小鼠脾淋巴细胞和NDV刺激抗原,37℃,5%CO2培养7小时.裂解细胞,依次加入酶标二抗、底物、显色液,倒置显微镜下计数ELISPOT斑点.结果:ELISPOT试验的特异性与培养时间和刺激抗原浓度密切相关.在106/孔的脾淋巴细胞浓度下,培养时间越长、刺激抗原越多,试验的特异性越低;当培养时间为7小时,抗原量为5 μg/孔时,试验的特异性强.ELISPOT斑点数,随细胞浓度的增加而增加,当小鼠的脾淋巴细胞浓度为106/孔时,有利于斑点的计数,试验误差小.结论:试验成功建立了检测NDV细胞免疫的ELISPOT方法,可用于NDV细胞免疫的研究.
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一种IFN-γ ELISPOT检测方法的建立
目的:建立检测一种融合蛋白疫苗诱导特异性细胞免疫的ELISPOT实验方法,通过分析免疫小鼠分泌IFN-γ的水平,评价疫苗诱导的细胞免疫应答效应.方法:以融合蛋白疫苗免疫C57BL/6小鼠,14天后加强免疫一次,于第28天无菌取脾,分离脾淋巴细胞,计数并调整细胞浓度,在已包被好的ELISPOT板中分别加入细胞悬液和刺激肽进行刺激培养.裂解细胞,依次加入酶标二抗、底物、显色液,在ELISPOT读板仪进行斑点计数和分析.结果:ELISPOT检测结果与动物免疫途径、细胞培养时间、细胞密度、肽浓度等条件密切相关.实验结果证明:采用皮下注射的免疫途径,免疫效果佳;小鼠脾淋巴细胞浓度为4×105个/孔,加入1 μg/孔的刺激肽刺激培养24～48小时的条件下,产生的特异性斑点数多,本底干扰小,有利于结果判断.结论:实验建立了IFN-γ ELISPOT检测方法,可用于该融合蛋白疫苗细胞免疫研究.
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重组减毒大肠杆菌对真核表达的CD8+ T细胞表位的运送研究
目的:分析体外、体内重组减毒大肠杆菌运送真核表达的CD8+ T细胞表位的效应.方法:将携带融合表达绿色荧光蛋白(GFP)与OVA CD8+ T细胞表位基因真核表达质粒的重组大肠杆菌13A(pG2F)感染抗原提呈细胞(APC)LKb和骨髓源树突状细胞(BMDC),应用体外抗原提呈试验检测APC对重组菌运送的CD8+ T细胞表位的提呈效应.同时,重组菌13A(pG2F)以静脉注射方式免疫C57BL/6小鼠,应用ELISPOT法检测特异性IFN-γ分泌细胞.结果:感染试验表明,大肠杆菌13A能向APC中运送真核表达质粒,并且外源GFP基因获得了表达.体外抗原提呈试验结果显示,在感染的早期(2小时),LKb和BMDC均可提呈重组菌13A(pG2F)运送的T细胞表位;在感染的晚期(48小时),LKb细胞对CD8+ T细胞表位的提呈效应增强.在同样的作用条件下,BMDC对减毒菌运送的抗原表位的提呈效应要强于LKb细胞.体内结果显示,大肠杆菌可以有效运送真核表达的CD8+ T细胞表位并诱导小鼠产生特异性细胞免疫应答.结论:重组减毒大肠杆菌在体外和体内均能有效运送真核表达的CD8+ T细胞表位,为基于减毒细菌的新型基因工程疫苗的分子设计提供了有益借鉴.
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重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平ELISPOT检测方法的建立
目的 建立检测重组痘苗病毒(Recombinant Tiantan vaccinia,rTV)艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法.方法 rTV艾滋病疫苗经皮内注射BALB/c小鼠,免疫后1～6周,采集小鼠脾细胞,ELISPOT法检测小鼠细胞免疫水平,确定佳检测时间,并对免疫剂量、肽库刺激浓度进行优化.应用ELISPOT方法对3批rTV疫苗成品进行检测,验证该方法的适用性；按现行检定标准对同批疫苗进行重复检测,验证该方法的重复性；应用ELISPOT和ICS方法同时对rTV疫苗进行检测,验证该方法与ICS法的相关性.结果 rTV艾滋病疫苗佳免疫剂量为50μl/只,免疫后4周,混合多肽库刺激终浓度为4μg/ml,淋巴细胞分泌IFNγ的水平较高；ELISPOT法适用性和重复性较好,且与ICS法具有较好的相关性(r=0.767,P＜0.05).结论 已成功建立了检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法.
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结核菌特异性 IFN －γElispot 检测在结核性脑膜炎患者诊断中的应用价值
目的：评价结核菌特异性 IFN －γElispot 检测方法在结核性脑膜炎病人中的应用价值。方法采用结核菌特异性 Elispot 方法检测了96例健康对照、89例肺活动性肺结核病人和16例结核性脑膜炎病人的结核菌抗原特异性 IFN －γ反应水平。结果Elispot 检测结核性脑膜炎病人 IFN －γ水平显著高于健康对照组（P ＜0．001），但低于肺结核病人（P ＜0．05）。各组人群中的 Elispot 检测阳性率分别是肺结核病人89．89％、结核性脑膜炎病人62．5％、健康对照7．91％。结论采用 Elispot 检测结核菌特异性 IFN－γ用于诊断结核性脑膜炎病人可行，具有较好的应用价值。
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ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c辅助诊断结核病的初探
用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评估新型复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c在活动性肺结核病诊断中的临床价值.选取初治肺结核患者血常规标本50例和健康体检者血常规标本40例,分别作为结核组和健康对照组,分离PBMC,应用新型复合ESAT 6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c与ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为抗原对受试者标本进行ELISPOT实验,检测两者斑点形成的细胞数量并进行比较.结果显示,复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c与ESAT-6/CFP-10融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为86％(43/50)、82％(41/50),特异度依次为82.5％(33/40)、85％(34/40).研究表明,应用新型复合蛋白ESAT-6/CFP 10/Rv3425/Rv3248c作为抗原建立的ELISPOT法辅助诊断结核病具有较高的潜在应用价值.
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寻常型天疱疮患者抗原特异性Th细胞的研究
目的 探讨寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)患者抗原特异性Th1和Th2细胞在不同疾病阶段的变化,进一步了解自身反应性T细胞在疾病中的作用.方法 收集24例PV患者资料,合成桥粒芯糖蛋白抗原肽段DG3(96～112).体外用该肽段分别刺激患者的外周血单一核细胞(PBMC),用酶联免疫斑点(ELISPOT)方法检测干扰素(IFN)-γ+ Th1细胞和白介素(IL)-4+ Th2细胞的数量,以及记忆性B细胞的数量.用t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)对各组数值进行比较,用Pearson相关系数对Th细胞、记忆性B细胞及抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)抗体滴度进行相关性分析.结果 24例PV患者男女比例1.67:1,平均年龄(56.59±14.66)岁.5×105个PBMC中,PV患者特异性IFN-γ+ Th1细胞绝对数为420.18±350.29,高于健康对照145.12±86.56,差异有统计学意义(P＜0.05).PV患者特异性IL-4+ Th2的细胞数(366.76±192.44)与健康对照(335.88±164.96)之间差异无统计学意义.PV患者外周血中特异性IL-4+ Th2占总Th2细胞的百分率为37.03％±23.44％,特异性IFN-γ+ Th1细胞为23.62％±16.77％;7例患者进行了治疗前后的自身对照比较.特异性IL-4+ Th2细胞的数量在治疗后(241.68±160.60)较治疗前(452.82±199.29)明显下降,差异有统计学意义(t=2.48,P＜ 0.05).特异性Th细胞、记忆性B细胞及抗Dsg3抗体滴度之间无统计学相关性(均P＞0.05).结论 抗原肽段DG3(96～112)含有被PV患者特异性Th细胞识别的致病性抗原表位;特异性IFN-γ+ Th1细胞和IL-4+ Th2细胞均在疾病中发挥一定的作用;特异性IL-4+ Th2细胞在疾病活动中可能起到了更重要的致病作用.
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念珠菌定植引发侵袭性感染早期优势抗原的体液免疫回忆应答
目的：临床发现侵袭性念珠菌病早期，患者抗念珠菌Eno抗原IgG抗体水平升高，本文拟用动物实验探讨该现象是否与念珠菌定植导致的体液免疫回忆应答有关。方法小鼠用随机数字表法分为4组：第1组小鼠先行口腔定植念珠菌而后进行腹腔感染（定植后感染免疫正常组，n＝8），第2组在第1组基础上外加免疫抑制处理（定植后感染免疫抑制组，n＝8），第3组给予念珠菌定植，不进行腹腔感染（定植未感染免疫正常组，n＝4），第4组不给予念珠菌定植，直接进行腹腔感染（未定植感染免疫正常组，n＝4）。检测免疫正常和免疫抑制状态的感染小鼠脾中念珠菌烯醇化酶（ Eno ）特异的记忆B细胞（ Bm）的数量以及血清抗Eno IgG、IgM和IgA水平。结果定植后感染免疫正常组和定植后感染免疫抑制组小鼠 Eno抗原特异性Bm数（47．25±13．81、43．14±15．95）明显多于定植未感染免疫正常组和未定植感染免疫正常组（8．00±3．74、8．50±2．38），差异有统计学意义（ P＜0．01）；而定植后感染免疫正常组和定植后感染免疫抑制组、定植未感染免疫正常组与未定植感染免疫正常组间差异无统计学意义（ P＞0．05）。念珠菌定植后感染的小鼠血清抗Eno IgG水平较IgM、IgA水平显著升高；抗Eno IgG水平与特异性Bm频数呈正相关（r＝0．737，P＜0．01）。抗Eno IgG水平与特异性Bm频数呈正相关（r＝0．737，P＜0．01）。结论念珠菌定植并在遭受侵袭性感染后特异性记忆细胞短时大量增殖可致Eno特异性IgG抗体水平快速升高。
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ELISPOT检测在结核性脑膜炎诊断中的研究
目的：利用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测脑脊液中结核抗原特异性的INF-γ分泌细胞数量，研究其在结核性脑膜炎诊断中的价值。方法对104例结核性脑膜炎患者和40例非结核性脑膜炎患者进行脑脊液与血的ELISPOT检测，并与脑脊液抗酸染色涂片、结核菌培养、荧光定量PCR、结核抗体检测进行敏感度和特异性的比较。结果脑脊液ELISPOT检测的敏感度为67.3％、特异性为89.2％，PV＋值94.3％优于其他检测方法，差别具有统计学意义（P＜0.05），脑脊液ELISPOT检测具有较好的诊断价值（Kappa＝0.856， P＜0.001）。结论脑脊液ELISPOT检测对结核性脑膜炎诊断的敏感度及特异度高，有望成为快速诊断结核性脑膜炎的一种方法。
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三种检测方法对结核性胸膜炎诊断价值的探讨
目的 探讨腺苷脱氨酶(ADA),结核蛋白芯片,结核分枝杆菌特异性酶联免疫斑点技术(ELISPOT)三种方法在结核性胸膜炎诊断中的应用价值.方法 对102例结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清和48例非结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清分别用ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT三种方法进行检测.结果 胸液中的ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT的灵敏性分别是84.3%、52.9%、97.1%,特异性分别是85.4%、89.6%、97.9%;血清中的ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT的灵敏性分别是31.4%、74.5%、91.2%,特异性分别为75.0%、93.8%、95.8%.结论 胸水的ADA检测,血清的结核蛋白芯片检测,胸水与血清的结核分枝杆菌特异性ELISPOT检测对结核性胸膜炎有较高的灵敏性与特异性,对结核性胸膜炎有较高的临床诊断价值.
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结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用
以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).
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自身免疫糖尿病细胞免疫学研究进展
自身免疫糖尿病是一种T细胞介导的胰岛β细胞选择性破坏的自身免疫病.主要组织相容性复合物(major histocompability complex,MHC)限制性中枢及外周T细胞自身耐受丧失,细胞免疫调节失衡,胰岛自身抗原反应性T细胞克隆活化,Th1细胞及其细胞因子释放占优势,将启动、维持和加速自身免疫性胰岛炎,导致糖尿病发生.应用ELISPOT和可溶性MHC-肽四聚体技术并解决T细胞分析的标准化问题,将显著促进自身免疫糖尿病与细胞免疫学研究的发展.
