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含EBV-LMP2基因重组腺病毒修饰的树突状细胞疫苗体内外特异性抗瘤作用的研究
鼻咽癌(NPC)在东南亚地区,尤其在我国南方地区发病率高达40/10万～60/10万.Epstein-Barr virus(EBV)在鼻咽癌的病因学中有着十分重要的作用,在肿瘤细胞中该病毒的存在为以CTL为基础的免疫治疗提供了一个潜在靶位.
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EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化
目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸(6 X His)的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.
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广西地区三类人群EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫状态的研究
目的 初步探讨广西地区鼻咽癌患者、血清VCA/IgA阳性高危人群及血清VCA/IgA阴性健康人群EB病毒LMP2特异性细胞免疫状态的差异.方法 选择广西苍梧地区经血清学筛查VCA/IgA阳性高危人群志愿者60例,对照为血清VCA/IgA筛查阴性的健康志愿者20例,同时选取广西壮族自治区人民医院经病理确诊鼻咽癌患者134例,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测外周血中LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫水平.比较鼻咽癌患者与健康志愿者、高危人群外周血LMP2特异性CTL免疫状态的差异.结果 鼻咽癌患者LMP2特异性CTL免疫水平明显低于健康志愿者及血清EB病毒抗体阳性人群,差异有统计学意义(P＜0.01);血清EB病毒抗体阳性三种不同滴度人群间LMP2特异性T细胞免疫反应差异有统计学意义(P=0.002);鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者同Ⅲ期及Ⅳ期患者的LMP2特异性T细胞免疫反应存在差异(P＜0.01).结论 三类人群间LMP2特异性CTL水平的差异可能是导致EB病毒长期潜伏感染并导致鼻咽癌发生的重要原因,针对LMP2的特异性免疫治疗有望降低鼻咽癌的发生率.
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含EBV-LMP2基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导CTL应答的初步探讨
目的构建包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗并探讨它在体内外的免疫性质. 方法采用pAdeasy-1系统构建包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗,并用IFA、PCR和TCID50等方法对其特异性进行鉴定.通过重组腺病毒感染人树突状细胞(DC),在体外活化自体T细胞;以及通过重组腺病毒感染小鼠淋巴细胞,皮下免疫同种小鼠,体内活化CTL评价其免疫效果. 结果通过PCR以及间接免疫荧光试验分别证实了病毒目的基因LMP2的存在以及蛋白在293细胞中的表达.采用TCID50方法,测定第6代的病毒滴度为2×108.体内外的免疫实验结果显示通过这两种方式均可以有效地引发针对EBV-LMP2的CTL反应. 结论包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗可以在体内外有效地引发CTL应答,这些资料为下一步临床应用含LMP2的重组腺病毒作为疫苗治疗和预防EBV相关肿瘤奠定了基础.
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食管鳞癌组织HLA-Ⅰ和TAP1及LMP2的表达相关性研究
目的 探讨食管鳞癌组织中发生肿瘤免疫逃逸机制的相关指标人类白细胞抗原-Ⅰ (human leukocyte antigenⅠ,HLA-Ⅰ)、抗原相关转运蛋白1(transporter associated with antigen proeessing1,TAP1)和低分子量多肽2(low molecular weight protein2,LMP2)的表达,分析三者表达的差异性和相关性.方法 应用免疫组化技术,检测济宁医学院附属医院胸外科2012-01-01-2013-12-31收治的临床资料完整的手术切除87例食管癌和配对正常食管组织中HLA-Ⅰ、TAP1和LMP2的表达,并分析其在食管癌组织中表达变化与临床病理特征的关系.结果 正常黏膜组织样本中HLA-Ⅰ阳性表达率为100.0％(87/87),TAP1为98.9％(86/87),LMP2为98.9％(86/87).在食管癌组织中HLA-Ⅰ阳性表达率为42.5％(37/87),TAP1为41.4％(36/87),LMP2为46.0％(40/87).与病理因素的相关分析显示,癌组织的分化程度、是否有淋巴结转移和肿瘤的TNM临床分期均与HLA-Ⅰ、TAP1和LMP2的表达相关,P值均＜0.05.HLA-Ⅰ类分子的表达与TAP1(P=0.05)和LMP2(P=0.04)的表达呈正相关,即随着TAP1和LMP2的低表达,HLA-Ⅰ也出现低表达.结论 在肿瘤发生免疫逃逸机制中,食管鳞癌组织HLA-Ⅰ、TAP1和LMP2出现低表达与组织分化程度、淋巴结转移和TNM临床分期相关.提示HLA-Ⅰ、TAP1和LMP2可能与食管鳞癌的发生和转移有关,三者可同成为食管癌诊断和预警转移有价值的生物标志物.
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溃疡性结肠炎的IL-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性研究
目的:研究溃疡性结肠炎(UC)病人的R-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性,并分析其与抗中性粒细胞胞浆抗体(AN-CA)及临床分型的关系.方法:用PCR-限制性片段多态性(PCR-FLP)方法和序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法分别对81例UC病人和114名健康者进行IL-1β、LMP2和IL-1RA基因多态性分析.结果:UC病人和健康者之间IL-1β、IL-1RA和LMP2各基因型和基因频率比较均无显著性差异(P＞0.05);当UC病人分为ANCA(+)组和ANCA(-)组后,发现ANCA(+)组IL-1RA等位基因2频率高于ANCA(-)组(13.7%对3.3%,P＜0.05),其它各基因型及基因频率比较,统计学上均无显著性差异(P＞0.05).结论:中国汉族UC病人与IL-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性无关联,但ANCA(+)UC病人IL-1RA等位基因2频率明显增加.
关键词： 溃疡性结肠炎 白细胞介素-1β 白细胞介素-1受体拮抗剂 LMP2 基因多态性 -
EBV-LMP2基因密码子优化对其蛋白表达及免疫效果的影响
为了研究对EBV-LMP2基因按照真核密码子偏好进行密码子优化后,对其在真核细胞蛋白表达水平以及引发细胞免疫能力的影响,我们对EBV-LMP2基因进行了完全改造,并构建了改造前后的Psectag/LMP2重组质粒,通过瞬时转染COS-7细胞检测其蛋白表达并进行了小鼠的DNA疫苗实验.结果表明,改造后的LMP2基因在真核细胞中的表达未见大幅提高,同时引发细胞免疫的能力也没有明显上升.结果提示,我们单纯按照密码子的偏好来改造基因并不一定能使蛋白的表达量和引发免疫反应的能力提高.
