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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化
目的将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化.方法采用PCR方法从VZV DNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序.重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36I digested)共转染Sf 9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI.通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性.结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72 h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58 000和70 000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似.动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体.SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80%.纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性.结论应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础.
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利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白
目的获得人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)L1蛋白.方法以pFB1为载体构建HPV 16L1杆状病毒表达质粒,并感染昆虫细胞Sf 9结果收集27℃,培养72 h的感染重组病毒的Sf 9,提取细胞蛋白.经SDS-PAGE蛋白电泳分析,发现有一相对分子质量为56 000的蛋白表达,Western blot证实所表达的蛋白为HPV16 L1.结论昆虫-杆状病毒表达系统可有效地表达HPV 16 L1蛋白.
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EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化
目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸(6 X His)的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.
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人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制
目的运用噬菌体表面表达技术,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG.方法从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库.用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段,并在E.coli中进行分泌性表达.通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体,并进行序列测定.然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上,转染昆虫sf-9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白.结果分离到一株Fab克隆AAVs-31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光试验呈阳性,序列分析结果表明是一新的序列,所获得的基因为人源IgG Fab基因,由Gamma链和Kappa链组成.表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白.结论用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段,并在真核系统中表达了其全抗体,它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位.
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呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化
目的 研究人呼吸道合胞病毒(human respiratory syneytial viruse,RSV)分泌型融合蛋白(secreted fusion protein,sF)基因在杆状病毒中的表达及纯化.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列.获得COOH'端带有His标签的重组sF-His蛋白编码基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒,用脂质体Cellfectine reagent转染sf9细胞,实现sF在sf9细胞中的表达,Ni柱亲和层析纯化sF蛋白.结果 成功获得了sF-His编码基因,构建的重组杆状病毒可高效表达sF,Ni-柱纯化后sF的浓度为1.084 mg/ml,纯度达90%以上.结论 杆状病毒系统是制备8F的有效方法,纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础.
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抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达
目的探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达.方法将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达.结果获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化,轻重链表达产物位置大小正确,HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,并能在体外中和甲肝病毒,另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性,但系抗不同位点的抗体.结论获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性,且为抗不同位点的抗体,为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础,为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施.
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H5N1禽流感病毒headless HA基因在杆状病毒中的表达
目的 建立能有效表达禽流感病毒A/Hubei/1/2010( H5N1)无头HA( headless HA)的杆状病毒系统.方法 利用RT-PCR扩增获得headless HA基因,克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,命名为pFastBac1headless HA.将pFastBac1headless HA转化到DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒Headless HA-Bac.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,并进行Western Blot和红细胞凝集试验检测.结果 Headless HA在Sf9细胞中能有效表达,不能使红细胞发生凝集.结论 本研究为利用headless HA表达蛋白研制广谱流感疫苗奠定了基础.
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H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定
目的 构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒.方法 用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒(A/PR8/34)全长神经氨酸酶基因,并将其连接于pFastBacdual载体,构建杆状病毒转移载体pFBD-NA.转化含有Bacmid的DH10B感受态细胞后,获得重组穿梭载体rBacmid-NA.将其转染昆虫细胞sf9,获得重组病毒rBac-NA.提取重组杆状病毒rBac-NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光,SDS-PAGE,Western Blot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白.结果 经PCR鉴定所构建质粒rBacmid-NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面,Western Bolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测,NA蛋白可被鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体特异性识别.结论 上述结果证明,我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒,为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础.
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基孔肯雅病毒样颗粒的制备及免疫原性研究
目的 评价基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒(VLPs)免疫原性.方法 通过构建CHIKV结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1昆虫细胞表达载体,然后与杆状病毒线性DNA共转染SF9昆虫细胞制备重组杆状病毒,感染悬浮培养的SF9细胞制备VLPs.IFA、SDS-PAGE和Western-Blot法对表达产物进行鉴定分析,用纯化VLPs免疫BALB/c小鼠,评价免疫原性.结果 CHIKV结构蛋白装配形成病毒样球形颗粒,免疫小鼠可诱导CHIKV特异性抗体,能够有效中和CHIKV感染Vero细胞.结论 CHIKV VLPs能够通过杆状病毒系统在昆虫细胞中有效分泌表达,并具有较强免疫原性,为基于CHIKV VLPs的免疫学检测试剂乃至疫苗的研制奠定了基础.
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柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒免疫原性的初步研究
目的 研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的免疫原性.方法 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统共表达3CD及P1蛋白,制备CA16病毒样颗粒,通过SDS-PAGE及透射电镜等方法对VLPs进行鉴定,以氢氧化铝佐剂免疫ICR小鼠,并对乳鼠经颅腔攻毒.对病毒样颗粒疫苗的免疫原性及保护效果进行评价.结果 将重组CA163CD及P1蛋白的杆状病毒转染SF9细胞,可以产生类似CA16病毒颗粒的大小为27 ～ 30 nm的VLPs.小鼠免疫试验结果显示CA16 VLPs可以刺激产生较高水平的抗CA16病毒的特异性IgG抗体及中和抗体,乳鼠攻毒试验结果显示,母传抗体保护率高达90％.结论 CA16 VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的体液免疫反应,并且母传抗体可以保护乳鼠抵御经颅腔的病毒攻击.
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呼吸道合胞病毒F蛋白第168～289氨基酸片段的昆虫细胞表达及其抗原性分析
目的 研究人呼吸道合胞病毒(RSV)F基因第546～881碱基编码的融合蛋白(即F蛋白)主要抗原性区域第168～289氨基酸片段的抗原性初步探讨其作为诊断抗原的应用价值.方法 用逆转录(RT)-PCR的方法扩增出RSV Long株F基因546～881 bp片段(F'),将其插入到转移载体质粒pBacPAK9中,获得相应的重组质粒pBacRSV F',与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36 Ⅰ酶切)共转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒BacPAK F',并在昆虫细胞中表达.重组蛋白用Ni2+螫合柱亲和层析纯化,用免疫印迹(Western blot,WB)法检测重组蛋白的抗原活性.并用该方法检测33例急性下呼吸道感染患儿血清特异性抗体,同时用间接免疫荧光法检测患儿的鼻咽分泌物中RSV抗原.对两种方法检测标本的阴性率进行比较.结果 重组病毒BacPAK F'在昆虫细胞中表达相对分子质量约13 000的重组蛋白.纯化后的重组蛋白能与特异性抗RSV抗体结合.WB检测33例急性下呼吸道患儿血清特异性抗体,结果显示阳性11例,阳性率为33.3%,免疫荧光法检测结果阳性9例,阳性率为27.3%,2种检测方法阳性率差异无统计学意义(x2=0.29,P>0.05).结论 纯化后的在昆虫细胞中表达的RSV F基因546～881 bp片段编码的融合蛋白片段具有较强的抗原活性,对RSV感染的快速诊断具有一定的临床应用价值.
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天蚕素 B-黄体生成素释放激素结合部位重组基因的构建及其抑癌功能的研究
目的 构建天蚕素B-黄体生成素释放激素结合部位(CB-LHRH')重组基因,探讨CB-LHRH'蛋白成为新型抗肿瘤靶向药物的可能性.方法 设计并人工合成CB-LHRH'重组基因序列,应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达目的 蛋白并通过蛋白斑点印迹法鉴定,采用二甲氧唑黄(XTT)比色法检测不同剂量的目的 蛋白对卵巢上皮性癌细胞株SKOV3(LHRH受体阴性)和子宫内膜癌细胞株HEC-1B(LHRH受体阳性)细胞的生长抑制率,并进行镜下形态观察.结果 蛋白斑点印迹法检测结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解液呈现棕色,证实CB-LHRH'蛋白已表达.重组杆状病毒感染的昆虫细胞系Sf9细胞裂解液对SKOV3及HEC-1B细胞的生长抑制率,随作用时间的延长和剂量的增加而增加,SKOV3细胞的生长抑制率从(5.03±0.08)%增加至(53.24±1.22)%,HEC-1B细胞的生长抑制率从(5.13±0.37)%增加至(56.16±1.08)%.相同剂量的重组杆状病毒感染的St9细胞裂解液,作用相同时间,其对HEC-1B细胞的生长抑制率高于SKOV3细胞,差异有统计学意义(P＜0.01).经重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解液作用后,镜下可见癌细胞出现明显改变甚至成片坏死崩解为无定形的颗粒状物质.结论 CB-LHRH'蛋白可有效杀伤LHRH受体阳性的HEC-1B细胞,有望成为治疗表达LHRH受体的肿瘤的抗肿瘤靶向药物.
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CEA CTL-Th融合表位疫苗的优化设计及其重组杆状病毒表达载体的构建
目的:构建CEA CTL-Th融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒表达载体,探索开发新型高效CEA疫苗的新途径.方法:应用PCR技术从质粒114KL1pFastBacl中扩增HPV16L1片段,并连入T载体(pMD18-T);通过酶切和连接将HPV16L1片段和CEA-PADRE可退火引物克隆至杆状病毒转移质粒pFastBacl的相应酶切位点;终通过转座效应得到融合表位疫苗的重组杆状病毒表达载体.结果:重组子通过测序和PCR等方法分别得到验证.结论:成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒表达载体.
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重组杆状病毒载体介导大鼠螺旋神经节细胞基因转染的研究
目的 探讨重组杆状病毒(baculovirus,Bac)作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点.方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的杆状病毒载体(Bac-GFP),以不同感染复数(multiplicities of infection,MOI)的病毒和不同浓度的丁酸钠转染大鼠螺旋神经节细胞,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞转染率和绿色荧光蛋白表达强度,并观察杆状病毒和丁酸钠对螺旋神经节细胞的毒性.结果 杆状病毒可以高效转染螺旋神经节细胞,转染效率达77.69%.Bac-GFP转染率和表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而提高.GFP在转染后6 h开始表达,第2天达到高.重组杆状病毒MOI小于800以及丁酸钠终浓度小于或等于10 mmol/L时,对螺旋神经节细胞没有明显细胞毒性.结论 重组杆状病毒可以在体外高效安全转染内耳螺旋神经节细胞.
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Q型人血清对氧磷酶在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达
目的研究对氧磷酶与心血管疾病的关系.方法采用BAC-TO-BAC杆状病毒系统表达Q型人血清对氧磷酶(PON-1),在已获得人PON-1全长cDNA的基础上,通过PCR扩增,得到上游含EcoRⅠ酶切位点,下游不含终止密码子而含HindⅢ酶切位点的PON-1基因,将其克隆到带有6×His@Tag的pFASTBACⅡCD14质粒中,构建杆状病毒转移载体pFASTBACⅡ-PON-1.将含有PON-1基因的重组质粒pFASTBACⅡ-PON-1转化DH10BAC感受态细胞,使目的基因通过同源重组插入Bacmid DNA中.PCR鉴定正确后再转染入sf9昆虫细胞中,产生有感染力的重组杆状病毒.用乙酸苯酯为底物测定表达上清液中的酶活性.结果比较不同感染复数(MOI)和不同感染时间PON-1在培养上清液中的表达情况,确定感染复数MOI为6～8,感染时间96～108 h为PON-1的佳表达条件,产率约为4.5 mg@L-1上清液.免疫印迹法表明重组蛋白有与抗6×His单克隆抗体结合的抗原性.顺磁共振实验证明,基因工程产人重组血清对氧磷酶rhPON-1能有效清除Fe2+诱导亚油酸脂质过氧化产生的脂质自由基,清除率为55.9%.结论BAC-TO-BAC杆状病毒介导的草地贪夜蛾昆虫细胞sf9可高效表达Q型人血清对氧磷酶.
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人细胞色素P450 3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18重组酶的异源表达与活性
目的 重组表达人细胞色素P450(CYP)3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,为CYP3A4代谢活性的体外研究提供单一酶源.方法 应用杆状病毒表达系统构建含有上述各CYP3A4突变体基因序列的重组病毒,将其连同含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-P450氧化还原酶(POR)和细胞色素b5基因的重组病毒共同感染昆虫草地夜蛾细胞Sf9得到CYP3A4突变体与POR和细胞色素b5共表达的重组蛋白,分别以高效液相色谱法和荧光分析法测定各重组酶对睾酮和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代谢活性.结果 在mRNA分子水平上验证了CYP3A4突变体CYP3A4*3, CYP3A4*4, CYP3A4*5和CYP3A4*18基因在Sf9细胞中的转录.感染了各重组病毒的Sf9细胞裂解液对睾酮和7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素有明显代谢.结论 应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在体外成功表达了具有催化活性的人CYP3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白, 其中CYP3A4.5活性显著低于野生型蛋白,CYP3A4.18活性显著高于野生型蛋白,而CYP3A4.3和CYP3A4.4与野生型蛋白活性近似.
关键词： 细胞色素P450 CYP3A4 突变 杆状病毒科 睾酮 -
以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法
目的:报道一种新的基因治疗方法.方法:将人全长血小板生成素(thrombopoietin, TPO)基因克隆至pBacMam-2载体,与BacVector-3000病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人TPO基因导入小鼠体内.结果:获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的2～3倍,RT-PCR结果显示TPO在小鼠组织中得到表达.结论:重组rhTPO昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体.
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重组人Versican G1蛋白在昆虫细胞中的表达
目的:利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备人蛋白聚糖Versican G1区(VG1)的重组蛋白.方法:将编码人VG1蛋白343个氨基酸的基因插入pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH10Bac,提取重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞,获取含重组人VG1蛋白的杆状病毒进一步感染昆虫细胞进行蛋白表达.通过Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行纯化.免疫印迹方法对昆虫细胞培养上清中的蛋白成分进行鉴定,采用透明质酸结合实验确定重组人VG1蛋白的生物活性.结果:人VG1基因在昆虫细胞中获得高水平表达,重组人VG1蛋白具免疫原性和与透明质酸结合的生物活性.结论:昆虫细胞表达的重组人VG1蛋白具有良好的免疫原性和生物活性.
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SARS冠状病毒N蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用
目的应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS-CoV N基因,产生无感染性的核蛋白,作为诊断抗原,用于检测血清中SARS特异性抗体.方法从一例输入性SARS病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SARS-CoV N基因,将它插入昆虫杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染sf 9昆虫细胞,经丙酮固定,制成SARS特异性诊断抗原,建立检测病人血清抗SARS-CoV抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA).结果此抗原仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常人及其他发热病人血清不起反应.经双盲试验,与空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)阳性的2003年SARS病人血清的符合率为97.8%;检测2004年广东新发4例SARS病人进展期血清均阳性,发病后第6天即可检出抗体1∶ 40阳性,至第9天,升至1∶ 640.结论此法用于检测病人血清中SARS抗体,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,不需P3实验室,为诊断与研究SARS提供新的途径和手段.
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SARS-3CL蛋白酶基因在杆状病毒载体中的构建及其转染
目的:构建SARS冠状病毒3CL蛋白酶基因的杆状病毒重组供体质粒,包装重组3CL蛋白酶的杆状病毒,感染昆虫细胞进行表达.方法:首先扩增含3cl-Teagy和pFagtBac HTh的转化菌,用酶切连接法构建重组转座质粒pFB HTb-3cl.将该质粒转化E.coli DH10Bac感受态菌,在菌体内进行重组,并经三重抗性和蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HTb-3cl,对重组质粒Bacmid-HTB-3cl进行纯化并转染St9昆虫细胞包装杆状病毒,利用病毒感染St9昆虫细胞并进行蛋白表达.利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果:成功构建了重组表达载体并得到了重组杆状病毒,SDS-PAGE检测到有3CL蛋白酶表达.结论:3CL蛋白酶在昆虫细胞中的表达为蛋白活性的检测及抑制剂的筛选奠定了基础.
