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带有HBV基因的腺相关病毒为载体的重组病毒感染树突状细胞的研究
目的 探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)为载体的含有HBV-S、C或X基因的重组病毒(rAAV-HBV-S,C,X)感染正常人树突状细胞的效率.方法 分别构建含有HBV-S、C和X基因的AAV质粒,在293细胞中包装成重组病毒,测定病毒滴度.从正常人外周血中分离出单核细胞进行体外培养,在培养的第1天分别用rAAV-HBV-S、C、X和作为对照的293细胞裂解液感染刺激单核细胞,感染后的单核细胞在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下继续培养7 d获得成熟的树突状细胞.用RT-PCR及流式细胞仪细胞内染色检测HBV基因的RNA和蛋白的表达.结果 重组rAAV-HBV-S、C、X的病毒滴度可以达到107拷贝/ml,用重组病毒分别感染树突状细胞.与对照组相比,感染的树突状细胞可表达相应的HBV基因RNA,流式细胞仪检测显示约90%的树突状细胞有相应HBV蛋白的表达.结论 rAAV-HBV可有效感染树突状细胞,提示可以通过该途径刺激树突状细胞提呈抗原.
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重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达
目的 利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussia princeps luciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(firefly luciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点.方法 制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8-Gluc/Fluc,体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性；将不同剂量的rAAV8-Gluc/Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB/c小鼠,通过尾静脉采血检测Gluc活性,通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性.结果 成功制备了rAAV8-Gluc/Fluc,可以有效感染HEK293细胞,同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc；尾静脉注射或肌内注射rAAV8-Gluc/Fluc至小鼠后,外周血Gluc活性均在注射后10 ～20 d达到高峰并稳定持续120 d以上,Gluc活性随注射剂量增加而增高；静脉注射rAAV8-Gluc/Fluc时Fluc主要在肝脏表达,在骨骼肌和心肌有少量表达,而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达.结论 本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8-Gluc/Fluc,研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点,为rAAV8的临床前应用打下基础.
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过氧化物还原酶3在宫颈病变中的表达特点
目的 检测过氧化物还原酶3在宫颈病变中的表达特点,以进一步探讨宫颈癌发生、发展的作用机制.方法 用免疫组织化学染色方法检测过氧化物还原酶3在宫颈癌中的表达特点.另外用含有人乳头瘤病毒16亚型E6/E7基因的重组腺相关病毒转染宫颈上皮细胞,通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测转染前后过氧化物还原酶3表达水平的变化.结果 过氧化物还原酶3在宫颈癌中的表达显著高于正常宫颈组织.宫颈上皮细胞感染重组腺相关病毒前后过氧化物还原酶3的表达水平没有显著变化.结论 过氧化物还原酶3与高危型HPV感染以及宫颈上皮细胞的恶性转化没有直接关系.而是在官颈癌发病以后,由于肿瘤细胞内的活性氧族增多,导致过氧化物还原酶3的表达上调.
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腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头瘤病毒18型E6E7基因构建及其转化作用的鉴定
目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)的E6E7基因在细胞恶性转化中所起的作用.方法将人乳头瘤病毒(HPV)的E6E7基因克隆至腺病毒伴随病毒表达载体中,通过包装的重组病毒感染,将E6E7基因导入并整合到永生293细胞的基因组中.结果本研究成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒并感染了永生293细胞,PCR/Southern杂交分析表明E6E7基因在转化细胞293TL中确有表达,转化细胞293TC和293TL具有明显的转化表型,和亲本293细胞相比,生长速度快,接触抑制消失,集落形成率提高20倍,且集落明显增大,形成时间短.结论成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒,HPV18 E6E7基因可引起永生化人上皮细胞293的恶性转化.此病毒可用于感染正常上皮细胞,研究其致癌机制.
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人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制
目的运用噬菌体表面表达技术,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG.方法从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库.用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段,并在E.coli中进行分泌性表达.通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体,并进行序列测定.然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上,转染昆虫sf-9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白.结果分离到一株Fab克隆AAVs-31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光试验呈阳性,序列分析结果表明是一新的序列,所获得的基因为人源IgG Fab基因,由Gamma链和Kappa链组成.表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白.结论用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段,并在真核系统中表达了其全抗体,它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位.
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超声靶向辐照微泡造影剂介导重组腺相关病毒转染肾癌细胞
目的 以肾癌细胞为研究对象,探索超声靶向破坏微泡(UTMD)技术对重组腺相关病毒(rAAV)转染率的影响.方法 应用不同感染复数(MOI)的rAAV2转染786-0细胞观察转染率.用不同条件UTMD预辐照rAAV2,观察病毒活性.以不同条件UTMD联合rAAV2转染人肾透明细胞癌(786-0)细胞,测定转染率及细胞生存率,RT-PCR检测细胞内病毒载体基因拷贝数.结果 1×104～1×106 MOI的rAAV2在786-0细胞的转染率为(17.28士2.44)%.UTMD声强≤2.0 W/cm2,时间≤120 s,微泡体积比≤40%,频率1 MHz,占空比(DC)50%,脉冲重复频率(PRF)100 Hz时,UT-MD辐照不影响rAAV2的转染活性.在不影响细胞生存率及rAAV2活性的参数下(声强1 W/cm2,时间60 s,微泡体积比20%,频率1 MHz,DC 60%,PRF 100 Hz),UTMD介导rAAV2组细胞的转染率较单纯rAAV组提高2～3倍,并在5天内稳定维持提高效应;实时PCR显示,UTMD介导rAAV2组细胞内病毒载体量较单纯rAAV组提高近9倍.结论 UTMD可安全、有效且稳定地提高rAAV2在肾癌细胞的转染率.
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超声辐照人血白蛋白微球与腺相关病毒感染人视网膜色素上皮细胞
目的 探讨超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球促进携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染人视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值.方法 HRPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×105/孔),加入微球与rAAV2-EGFP的混合液,在不同条件下进行超声辐照.48 h后,应用流式细胞仪测定阳性细胞比例,并且评估不同辐照条件对细胞增殖有无影响.结果 在声强1.0 W/cm2,辐照持续时间60 s,微泡细胞比值60∶1的条件下,全氟丙烷人血白蛋白微球组EGFP阳性细胞比例较对照组显著提高(P<0.001),MTS染色细胞生存率大于90%.结论 超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球能够安全地提高rAAV2-EGFP对人RPE细胞的感染效率.
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rAAV2-VEGF165治疗小型猪急性冠状动脉闭塞的有效性研究
目的在小型猪急性冠状动脉(冠脉)闭塞模型上,探讨重组腺相关病毒载体携带人血管内皮生长因子165基因(rAAV2-VEGF165)治疗冠脉闭塞性疾病的有效性及其量效关系,为进一步应用rAAV2-VEGFi65治疗慢性心肌缺血的研究探索较合适的剂量.方法以微开胸心肌内注射的方法将rAAV2-VEGF165导入小型猪心肌,实验组分成4个剂量组(n=3):1×1011v.g(virus genome),5×1011v.g,1×1012v.g,5×1012v.g.对照组(n=3)注射磷酸盐缓冲液(PBS).采用RT-PCR以及免疫组化方法观察各组VEGF165mRNA和蛋白的表达,通过心肌血管计数及冠脉造影,观察各剂量组促进血管生成的生物学效应.结果术后4周,各实验组心肌组织均可检测到VEGF165mRNA的表达,且各组VEGF165蛋白表达水平均高于对照组;1×1012v.g组及5×1012v.g组心肌毛细血管密度大于对照组,5×1011v.g组及其以上剂量组冠脉侧支循环分级的增加优于对照组.结论心肌内注射rAAV2-VEGF165能在缺血心肌中有效表达VEGF mRNA及其蛋白,在一定剂量范围,rAAV2-VEGF165能够增加缺血心肌毛细血管密度,促进闭塞冠脉的侧支血管生成.结果显示,在小型猪心肌缺血模型上,rAAV2-VEGF1651×1012v.g是较理想的剂量.
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腹腔注射分泌胰升血糖素样肽-1重组腺伴随病毒对db/db小鼠高血糖的影响
目的 观察腹腔注射分泌表达胰升血糖素样肽-1(GLP-1)的重组腺伴随病毒对db/db小鼠高血糖的纠正作用. 方法 将12只8周龄db/db小鼠随机分为对照组与实验组.测量体重、血糖.实验组腹腔注射分泌表达GLP-1的重组腺伴随病毒,对照组腹腔注射对照病毒.给药后分别于第2、4、6、8、10、12周测量体重,并检测血糖水平. 结果 随观察时间的延长,对照组体重、血糖呈上升趋势,实验组则下降.实验组2周时,体重(38.3±4.4)g,血糖(18.2±3.0)mmol/L,与对照组[(44.2±4.7)g、(22.6±4.5)mmol/L]比较,差异无统计学意义(P＞0.05).第4～12周时实验组体重和血糖均低于对照组,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 通过腹腔注射分泌表达GLP-1的重组腺伴随病毒方式,可纠正db/db小鼠高血糖.
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重组腺病毒相关病毒携带人血管内皮生长因子165诱导家兔缺血心肌血管生成的研究
目的将携带人血管内皮生长因子165(hVEGF 165)cDNA的重组腺病毒相关病毒(rAAV)载体注入家兔缺血心肌,观察血管内皮生长因子(VEGF)的血管生成效应.方法制作家兔急性心肌梗死模型,将rAAV-hVEGF165注入缺血心肌.4周后取注射部位心肌,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学、Western blot方法检测目的基因的表达,并计数注射部位心肌毛细血管数目,评价外源VEGF的生物学活性.结果注射rAAV-VEGF部位心肌VEGF mRNA及其蛋白的表达可持续8周,而且比对照组增加.远隔脏器未见外源VEGF的播散和表达.注射rAAV-VEGF部位毛细血管密度比对照组增加.结论rAAV-hVEGF 165可以有效地转染成年家兔心肌组织,外源基因稳定长期表达,同时能够刺激新血管生成,并具有良好的安全性.
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重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究
目的 探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果.方法 14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)、rAAV2(rAAV2-EGFP组6只,rAAV2-LUC组1只)分别转导入小鼠的心包腔内,使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达,冷光CCD相机体内监测LUC在心肌表达.结果 rAAV1-EGFP组绿色荧光出现于心肌组织全层;rAAV2-EGFP组绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞.rAAV1-EGFP组小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP组.rAAV1-LUC组小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC组.结论 在小鼠心脏中,rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体.
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激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及对脐静脉内皮细胞功能的影响
目的 构建激肽释放酶(HK)腺相关病毒(AAV)载体,检测重组病毒感染脐静脉内皮细胞系(HUVEC)后HK基因和内皮功能相关基因表达的变化.方法 HK基因克隆人腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS,和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、腺病毒辅助质粒pHelper共转染293细胞,包装成带有HK基因的重组腺相关病毒(rAAV-HK).以rAAV-HK感染HUVEC.RT-PCR法检测HK基因、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、凋亡蛋白酶(caspase-3)、内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素B1受体以及缓激肽B1受体、缓激肽B2受体的mRNA转录变化.ELISA法测定HUVEC上清液和胞内HK的含量.结果 成功构建了rAAV-HK.rAAV-HK感染HUVEC后,实验组胞内HKmRNA转录(0.59±0.12)比空白组(0.26±0.05)明显增加(P＜0.01);实验组胞内HK含量(120.1±40.9)比空白组(30.8±12.8)显著升高(P＜0.01);实验组eNOSmRNA转录(1.19±0.28)较空白组(0.66±0.11)增加(P＜0.05),实验组caspase-3mRNA转录(0.30±0.25)较空白组(0.67±0.27)减弱(P＜0.05).VEGF、内皮素-1、内皮素B1受体、缓激肽B1受体、缓激肽B2受体mRNA转录两组差异无统计学意义.结论 rAAV-HK病毒感染HUVEC后能高效表达HK,并促进HUVEC胞内eNOSmRNA转录,抑制caspase-3mRNA转录.提示导入HK基因能够改善内皮功能.
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人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达
目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达.方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAV-MCS-E7、含rep/cap基因的质粒pAAV-RC及辅助质粒pAAV-helper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度, RT-PCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达.结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml.含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后, 在细胞内可检测到HPV16E7 mRNA和蛋白的表达.结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7 mRNA和蛋白在真核细胞内有表达.
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重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因治疗裸鼠子宫内膜异位症
目的 研究重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素(endostatin)基因对子宫内膜异位症(内异症)裸鼠模型的治疗作用.方法 构建携带人血管内皮抑素基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺相关病毒载体rAAV2-endostatin-EGFP,,将2008年11-12月在天津医科大学第二医院妇科因子宫肌瘤行子宫全切除术的12例患者的子宫内膜种植于60只裸鼠的盆腹腔内,建立内异症裸鼠模型,1周后分为3组:治疗组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-endostatin-EGFP;阴性对照组20只,于病灶局部直接注射空白载体rAAV2-EGFP;空白对照组20只,于病灶局部直接注射等体积的磷酸盐缓冲液.分别于给药后1、2、3周各开腹1次,观察裸鼠盆腹腔病灶,同时留取异位病灶组织,检测各组裸鼠异位病灶中人血管内皮抑素蛋白表达情况、腺体数、微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况;于给药后3周检测各组裸鼠血清中雌二醇、孕酮水平.结果(1)采用腹膜种植法建立内异症裸鼠模型,种植成功率达100%.给药1周后,治疗组裸鼠异位病灶平坦、中央下陷,光镜下可见腺体数减少,腺腔变窄,细胞稀疏、呈萎缩状态.(2)荧光显微镜下观察,给药后1、2、3周,治疗组裸鼠异位病灶组织腺体和间质内出现绿色荧光;而阴性对照组和空白对照组裸鼠异位病灶组织内未见绿色荧光.(3)各组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数,治疗组分别为(7.8±1.9)、(7.0±1.5)和(5.5±1.7)个,均低于阴性对照组[分别为(10.1±1.7)、(10.2±2.0)和(9.8±2.4)个]和空白对照组[分别为(10.2±2.2)、(10.0±2.0)和(9.7±2.2)个],差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(4)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内的MVD,治疗组分别为(12.2±1.5)、(11.4±2.1)、(9.0±1.4)条,均低于阴性对照组[分别为(16.5±1.7)、(16.5±1.9)、(16.9±1.9)条]和空白对照组[分别为(16.2±1.6)、(16.0±1.6)、(16.3±1.7)条],差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内MVD比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(5)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF的阳性率及表达强度,治疗组分别为35%、30%、25%和1.60±0.43、1.33±0.30、1.03±0.36,均低于阴性对照组(分别为80%、75%、85%和2.43±0.53、2.43±0.29、2.66±0.45)和空白对照组(分别为85%、90%、90%和2.36±0.53、2.64±0.57、2.53±0.52),差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF阳性率及表达强度比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(6)给药后3周,治疗组裸鼠血清中的雌二醇、孕酮水平分别为(48±7)pmol/L、(61±8)nmol/L,分别与阴性对照组[分别为(50±9)pmol/L、(60±10)nmol/L]和空白对照组[分别为(48±7)pmol/L、(58±10)nmol/L]比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒可抑制裸鼠内异症病灶的血管生成,从而抑制异位病灶的生长,而不影响体内生殖激素水平,抗血管生成基因治疗可能成为内异症治疗的新选择.
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帕金森病大鼠三重目的基因共表达的长期行为改善
目的探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病基因治疗的效果.方法分别构建编码酪氨酸羟化酶(TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)基因的腺伴随病毒(AAV)载体,用复合感染的方式将AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH通过立体定向法注射入帕金森病大鼠损毁侧纹状体.采用免疫组化方法确定TH、AADC和GCH的表达;并连续观测基因转导后大鼠行为改善的情况长达1年.结果组织学依据显示TH、AADC和GCH基因均可在纹状体内长期有效而稳定的进行表达;三重基因转导可引起大鼠较TH和AADC共转导更为显著的行为改善(P<0.01).结论 AAV载体介导的TH、AADC和GCH三重基因纹状体内共表达对于帕金森病大鼠的基因治疗更为有效.
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重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究
目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用. 方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用. 结果 rAAV SMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复. 结论 rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法.
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EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞体外转移能力影响
目的 探讨EB病毒(epstein-barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP-1)对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞体外转移能力的影响.方法 设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(small hairpinRNA,shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体:rAAV-增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescentprotein,EGFP)和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定佳转染效率(multiplicity of infection,MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,划痕试验和基底膜穿透试验检验细胞转移能力的变化.结果 以rAAV-EGFP 5×10<'4>v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×10<'4>v.g/细胞转染C666-1后目的 基因抑制效率大于90%,划痕试验显示在相同的时间内,越过划痕边缘移动到空白处的细胞数明显减少(P<0.01),基底膜穿透试验提示细胞穿透能力显著下降(P<0.001).结论 通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,并显著抑制了肿瘤细胞的运动及穿透转移能力.
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干扰素α-1b抑制裸鼠肝异位鼻咽癌种植瘤生长和转移的研究
目的 观察干扰素α-1b对裸鼠肝异位鼻咽癌细胞株CNE-2种植瘤生长和转移的作用并探讨其机理;比较重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体介导干扰素α-1b(interferon-α-1b,IFN-α-1b)基因治疗与IFN-α-1b蛋白治疗的优势.方法 鼻咽癌细胞株CNE-2裸鼠肝包膜下注射,建立裸鼠肝脏鼻咽癌异位种植瘤动物模型;采用随机数字表法将40只裸鼠随机分为A～D组,每组10只;24 h后分别经尾静脉注射.A组:重组腺相关病毒携带人IFN-α-1b(rAAV-IFN-α-1b),C组:重组腺相关病毒携带增强型绿色荧光蛋白基因(rAAV-EGFP),D组:磷酸缓冲液;建模5 d后B组:皮下注射人IFN-α-1b,1次/隔日;3周后每组随机取5只裸鼠断髓处死,观察肝脏成瘤、肺转移及生存期情况,测量肿瘤体积大小,计算抑瘤率,原位末端标记法检测肿瘤细胞凋亡指数;高效液相芯片技术检测外周血中人IFN-α、小鼠IL-12的含量,另5只裸鼠观察生存期.结果 肝脏鼻咽癌异位种植瘤3周后,肿瘤平均体积((x)±s)分别为A组(0.114±0.116)cm3、B组(0.422±0.137)cm3、C组(2.476±0.637)cm3、D组(2.677±0.704)cm3,组间比较差异有统计学意义(F=38.536,P＜0.01);相对对照D组,A组和B组抑瘤率分别为95.74%、84.24%;A、B、C、D组肺转移率分别为0.0%、0.0%、40.0%、60.0%;凋亡平均指数分别为(21.88±3.29)%、(19.85±1.96)%、(4.37±0.50)%、(3.40±1.05)%,组间比较差异有统计学意义(F=120.964,P＜0.01);血清中人IFN-α平均含量分别为(101.50±11.33)pg/ml、(91.55±9.80)pg/ml、(23.06±4.36)pg/ml、(16.93±9.96)pg/ml,组间比较差异有统计学意义(F=69.128,P＜0.01);IL-12平均含量分别为(80.36±13.35)pg/ml、(51.15±9.72)pg/ml、(19.44±7.03)pg/ml、(14.49±4.21)pg/ml,组间比较差异有统计学意义(F=57.116,P＜0.01);平均生存期分别为(55.80±2.77)d、(48.20±2.39)d、(35.40±2.61)d、(36.80±1.92)d,组间比较差异有统计学意义(x2=25.623,P＜0.01).结论 IFN-α-1b能有效抑制裸鼠肝异位鼻咽癌细胞株CNE-2种植瘤生长和转移,重组腺相关病毒介导IFN-α-1b基因治疗效果优于IFN-α-1b蛋白.
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腺相关病毒介导胶质细胞源性神经营养因子转染牛眼虹膜色素上皮细胞
目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体对体外培养牛眼虹膜色素上皮细胞(IPECs)进行胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)转染,获得高效表达GDNF转基因细胞的可行性. 方法采用狭隙杂交测定AAV-GDNF的滴度,按感染复数(MOI)为50对传二代IPECs进行AAV-GDNF转染,于含3%胎牛血清DMEM培养基中连续不换液培养4周,酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞培养上清液中GDNF的量.同样方法对传二代IPECs进行AAV介导的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染,于含20%胎牛血清DMEM培养基中进行常规细胞培养.荧光显微镜下每2 d计数1次培养IPECs的GFP表达阳性率. 结果 (1)AAV-GFP转染后,IPECs生长正常,于转染后4 d部分IPECs开始出现GFP表达.GFP的表达在荧光显微镜490 nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质.转染8～10 d后,IPECs中GFP的表达至高峰.(2)根据ELISA检测结果、经过计算,AAV-GDNF转染IPECs的培养上清液中GDNF的含量为(17.14±1.10) μg/L. 结论 AAV-GDNF能有效地转染体外培养的IPECs和表达GDNF.
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血管内皮生长因子反义核苷酸抑制大鼠角膜新生血管的实验研究
目的探讨重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子反义核苷酸(rAAV-aVEGF165)抑制大鼠角膜新生血管(CNV)发生与发展的作用.方法三质粒共转染法构建rAAV-aVEGF165和重组腺相关病毒介导的β-半乳糖苷酶的结构基因(rAAV-Lacz).48只SD大鼠用抽签法随机分成实验组和对照组,每组24只,碱烧伤方法诱导CNV生成.实验组结膜囊注射rAAV-aVEGF165(1010pfu/ml),对照组结膜囊注射rAAV-Lacz(1010pfu/ml);5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)组织化学染色,检测Lacz基因在结膜囊中的表达情况;碱烧伤后1、2、4、7、14及30 d,形态学分析评价角膜新生血管的生长情况,免疫组织化学检测角膜组织中VEGF的表达.结果对照组rAAV-Lacz结膜囊注射2 d后,检测Lacz基因在结膜组织中的表达效率为21.36%±1.07%;30 d后Lacz基因在结膜下组织中的表达效率为28.02%±1.16%.碱烧伤后结膜囊注射rAAV-aVEGF165,实验组CNV面积明显减少,新生血管密度降低,VEGF在角膜组织中的表达明显降低,差异有统计学意义(F=1639.22,F=2187.16,F=719.17,P＜0.01).结论rAAV-aVEGF165能显著抑制碱烧伤后CNV的形成,其机制与降低角膜组织中VEGF的表达有关,重组腺相关病毒是眼反义基因治疗的有效载体.
