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昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达
目的 获得有效表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的重组杆状病毒和腺病毒,为研究HPV的免疫保护机制提供材料. 方法 按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16L1基因,利用Bac-to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒,利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPVl6L1基因的重组腺病毒载体.通过间接免疫荧光和Western blot对HPV16L1基因表达进行鉴定,利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成.结果 获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体,在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白,分子质量单位为56 ku,在Sf9细胞中可观察到VLP的形成. 结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因,在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达.
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利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白
目的获得人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)L1蛋白.方法以pFB1为载体构建HPV 16L1杆状病毒表达质粒,并感染昆虫细胞Sf 9结果收集27℃,培养72 h的感染重组病毒的Sf 9,提取细胞蛋白.经SDS-PAGE蛋白电泳分析,发现有一相对分子质量为56 000的蛋白表达,Western blot证实所表达的蛋白为HPV16 L1.结论昆虫-杆状病毒表达系统可有效地表达HPV 16 L1蛋白.
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人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达
目的在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)结构蛋白,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制奠定基础.方法将目的基因克隆至杆状病毒转移载体,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf 9,通过同源重组获得重组杆状病毒,用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白.结果获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为57 000和97 000,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的25%～30%.结论人乳头瘤病毒16型结构蛋白可在昆虫细胞内高效表达.
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共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察
目的构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株,并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价.方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16 E6和E7基因的重组痘苗病毒.该病毒免疫C57BL/6小鼠后,检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况.结果 PCR结果显示,重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7.5 K表达的ME6和ME7-1基因.动物实验结果表明, rVmE6E7在C57BL/6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生,被免疫小鼠能够抵抗HPV16 E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击.结论获得1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株,为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础.
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宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析
目的 分析泉州地区宫颈癌患者HPV16型E6/E7序列突变情况,探讨其与宫颈癌发生的相关性.方法 取35例HPV16阳性的宫颈癌组织标本,采用PCR法扩增E6、E7全长基因.PCR产物直接测序,并与野生型序列进行比对.分析E6、E7基因的变异情况.结果 E6、E7基因的突变率分别为91.4％和89.2％.E6基因中有10个位点为错义突变,2个位点为无义突变.氨基酸突变频率高的是D25E(77.1％).E7基因中共发现5个突变位点,有2个位点为错义突变,3个位点为无义突变,突变频率高是N29S和无义突变T846C(均为75.0％).结论 HPV16 E6、E7基因中常见突变位点D25E、N29S和T846C可能与宫颈癌的发生密切相关,可为研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索.
