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环状RNA与女性生殖和妊娠相关疾病
环状RNA(circular RNAs,circRNAs)是非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)的一种,由于无典型线性RNA 5,帽子结构和3,poly A尾,代之以共价环状结构而得名.新研究发现,circRNAs广泛、稳定且保守地存在于各种真核生物体内,可很好抵御RNA核酸外切酶R(RNase R)的降解,且其表达存在时间-空间特异性.通过作为miRNA“分子海绵”,调节可变剪接以及亲本基因表达,circRNAs能够在转录及转录后水平调控各项生命活动.多项研究表明circRNAs与卵母细胞和胚胎发育、卵巢上皮肿瘤以及子痫前期等的发生发展密切相关.本文将从生物合成、特性、功能以及与女性生殖和妊娠疾病联系等方面对circRNAs研究进展作一综述.
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CYP450s代谢酶基因表观遗传调控机制研究进展
生物转化是指外源性化学物在体内经酶促或非酶促反应转化为代谢产物的过程.生物转化过程包括Ⅰ相反应及Ⅱ相反应,其中Ⅰ相反应包括氧化、还原和水解反应.催化Ⅰ相反应的酶有95％为细胞色素P450酶系(cytochrome p450 enzyme system,CYP450s).大量研究显示CYP450s的持续性表达或诱导性表达受核受体和转录因子调控,这些转录因子包括:肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factors,HNFs)、芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)、雄烷受体(constitutive androstane receptor,CAR)、孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)等[1-2].
关键词： 代谢酶CYP450s 表观遗传学 环境化学物暴露 基因表达调控 -
Hormesis现象及其同工G-蛋白耦合受体机制
1 Hormesis现象的定义“剂量决定毒物”是16世纪著名的炼金术士及内科医生Paracelsus的名言[1],他首次将化学物质与矿物成分应用于医药治疗,并提出所有物质都是有毒的,只有剂量才能区别毒物的论点,成为毒物兴奋效应的雏形.19世纪德国微生物学家Schulz[2]观察到低浓度重金属离子可以促进酵母生长,进而认为这种现象可能普遍存在于各种化学物和生命体中,从而提出Amat-Schulz定律,即弱刺激加速生命力,中等强度刺激促进生命力,强刺激抑制生命力,但很强刺激却能致死.
关键词： Hormesis现象 G-蛋白耦合受体机制 基因表达调控 量效关系 -
肝细胞肿瘤标志物的研究与应用
肝细胞癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一,在中国其致死率居恶性肿瘤的第三位.本文对近几年来发现和检测到的肿瘤标志物在肝癌中的差异表达及其在肝细胞癌诊治中的应用和研究做一综述,希望能对肝癌的诊断、分类、预后判断以及指导治疗有所帮助.
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结核分枝杆菌感染对Ⅰ型干扰素受体基因表达的影响及其在结核病患者外周血表达的意义
目的 研究结核分枝杆菌感染对工型干扰素受体(IFNAR)基因表达的诱导作用及其在结核病患者外周血中表达的临床意义.方法 选取2013年1月至2013年5月在深圳市第三人民医院确诊的痰菌阳性的肺结核患者(TB组)15例;结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者(LTBI组)15例、健康对照(HC组)15例,均为同期医院体检人员.应用免疫磁珠从健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中分选CD14+单核细胞,在巨噬细胞集落刺激因子(M CSF)刺激下诱导分化为巨噬细胞,随后感染不同毒力结核分枝杆菌(H37Ra、H37Rv),应用实时定量PCR检测巨噬细胞中IFNAR1和IFNAR2基因表达情况,以2-△△Ct值表示IFNAR1和IFNAR2基因拷贝数.观测HC组、LTBI组、TB组患者各15例,分析不同人群PBMCs中IFNAR基因表达的差异.采用GraphPad 4.0软件对数据进行统计处理.多组计量资料数据首先进行齐性检验以判断是否符合正态分布,若符合正态分布,则用-x±s表示,并通过方差分析进行两两比较,从而计算q值.计数资料进行“行×列”表x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 经H37Rv刺激后,IFNAR1基因表达水平(5.95±0.41)显著低于空白对照(7.53±0.41),差异有统计学意义(q=4.15,P＜0.05);而H37Ra刺激后IFNAR1基因表达水平为(6.54±0.33),与空白对照(7.53±0.41)、H37Rv感染(5.95±0.41)相比差异均无统计学意义(q值分别为2.56、1.57,P值均＞0.05);而IFNAR2基因在H37Ra和H37Rv刺激后表达水平分别为(8.81±0.85)、(8.84±0.80),均显著低于空白对照组(12.67±1.15),差异具有统计学意义(q值分别为4.10、4.13,P值均＜0.05);而H37Ra和H37Rv刺激后IFNAR2的基因表达差异无统计学意义(q=0.02,P＞0.05).IFNAR1基因在TB、LTBI、HC三组人群之间表达水平分别为(5.39±0.64)、(6.59±0.86)、(7.08±1.10),两两比较差异均无统计学意义(TB vs HC,q=1.91;TB vs LTBI,q=1.53;HC vs LTBI,q=0.87;P值均＞0.05),而TB患者IFNAR2基因相对表达量为(5.96±0.58),显著低于健康对照组(10.01±1.58),差异有统计学意义(q=3.67,P＜0.05).结论 结核分枝杆菌感染可以诱导巨噬细胞IFNAR基因表达下调,且与菌株毒力无关.在结核病患者外周血中IFNAR2基因表达下调,具有潜在诊断价值.
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Ra1362调控环二鸟苷酸影响结核分枝杆菌H37Ra的生物膜发育和休眠
目的 通过敲除环二鸟苷酸(c-di-GMP)合成酶基因Ra1362探讨该基因在结核分枝杆菌(MTB)H37Ra株生物膜发育和休眠中的作用.方法 以MTB H37Ra株为出发菌株,敲除合成酶基因Ra1362获得基因敲除株△Ra1362,通过体外实验比较细菌的生物膜形成变化;应用转录谱基因芯片和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测野生株和敲除株基因表达的情况变化;同时构建体外快速厌氧休眠模型比较细菌克隆形成、休眠相关基因的表达和活细胞染色情况.结果 △Ra1362株于痰液管中培养26 d时已形成较厚的皱褶生物膜,形成生物膜的速度明显快于野生株5d;转录谱基因芯片和定量RT-PCR结果也显示△Ra1362株中19个与休眠相关基因的表达水平下调并能通过基因回补和外源添加c-di-GMP所补偿;在快速厌氧模型中发现,迟缓期过后△Ra1362株对氧气的消耗比野生株组要快12h,且细菌处于不能恢复正常生长的休眠状态.结论 Ra1362基因通过控制c-dLGMP的合成调控MTB感应缺氧或者氧化还原压力,一方面调控生物膜的发育,另一方面在缺氧条件下通过调控DosR调节子基因的表达来调节细菌的休眠.
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功能性单核苷酸多态性调控结核病易感的分子机制研究
目的 通过构建花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)启动子区域rs3840880位点不同基因型的双荧光素酶表达质粒,分析此单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)对ALOX-12基因启动子活性的影响及其对基因表达的影响,阐明功能性SNP调控结核病易感的分子机制.方法 从全血样本中提取人全基因组,PCR扩增ALOX-12基因启动子区域包含rs3840880位点在内的约1700 bp的基因片段,构建pGL3-Basic-rs3840880G质粒,对此质粒进行定点突变得到pGL3-Basic-rs3840880 D放散型(DEL)质粒,分别转染人宫颈癌细胞株Hela细胞后使用双荧光报告酶检测系统(dual luciferase assay system)检测相对荧光值.结果 成功构建了ALOX-12基因启动子区rs3840880位点等位基因G的表达质粒pGL3-basic-G,采用定点突变技术成功将pGL3-basic-G质粒改造为pGL3-Basic-DEL质粒,测序验证后,两质粒其他序列完全相同.分别将此两个质粒转染Hela细胞并检测相对荧光比值[荧光值(F)/荧光?]后,发现pGL3-Basic质粒F/R=0.129,等位基因G的F/R=0.194,低于等位基因DEL质粒的F/R(0.274),采用单因素方差分析,二者之间的差异有统计学意义(F=25.09,P=0.001).结论 不同等位基因构建的质粒转染细胞后,荧光报告基因的表达差异具有统计学意义,故ALOX-12基因启动子区域的功能性SNPs确实能够影响启动子的活性,从而调控结核病的易感性.
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心肌干细胞研究进展
随着干细胞研究的不断发展,心肌干细胞(CSC)终于获得成功分离和鉴定,对于探明心脏疾病发病机制等基础研究具有重要意义,也为细胞心肌成形(CCM)治疗心衰和心肌梗死等心脏疾病的临床研究提供了理论依据.本文就心肌干细胞的调控机制、向心肌谱系的分化机制及在干细胞移植治疗心脏疾病方面的进展进行简要综述.
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表观遗传流行病学
一、表观遗传学和表观遗传流行病学近年研究表明,高等生命遗传信息的复杂性不仅在于基因组有更多的结构蛋白基因编码,还在于基因表达调控机制的复杂性.因此基因表达调控是现代分子生物学的核心.
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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定
目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒.酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,涂板后经G418梯度浓度筛选,获得多株抗G418 4.0 mg/ml的高拷贝菌株,扩大培养后,利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白,表达上清用Ni-NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定.结果 成功构建pPIC9K-DENV-1～4 EDⅢ重组质粒,高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白,纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳,相对分子质量约为12×103,与实际相符.免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合.结论 成功通过毕赤酵母高效分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白,这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究.
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不同膳食脂肪酸对大鼠乳腺癌细胞核受体基因表达的影响
目的 探讨核受体基因表达在不同膳食脂肪酸影响大鼠乳腺癌发生中的作用.方法 用8种不同膳食脂肪酸(饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、n-6多不饱和脂肪酸、n-3多不饱和脂肪酸、1∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸、5∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸、10∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸、1∶2∶1饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸其中n-6/n-3多不饱和脂肪酸1∶1)喂养SD雌性幼年大鼠,采用50 mg/kg的甲基亚硝基脲单次腹腔注射诱导大鼠乳腺癌发生,电镜观察大鼠乳腺细胞结构变化,BrdU体内标记法检测大鼠乳腺细胞增殖活性,RT-PCR分析乳腺组织过氧化物酶增殖活化受体(PPARβ和PPARγ)mRNA表达.结果 无乳腺癌诱发的各对照和n-3多不饱和脂肪酸诱癌组大鼠乳腺细胞超微结构正常,细胞增殖活性低.而有大鼠乳腺癌诱发的组织细胞内可见明显的腺癌标志,且高乳腺癌诱发的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、n-6多不饱和脂肪酸、5∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸、10∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸和1∶2∶1饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸喂养组大鼠乳腺细胞增殖活性升高(BrdU阳性率为21%～22%),但1∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸低诱癌组乳腺细胞增殖活性明显降低上述高乳腺癌诱发组(BrdU阳性率为13%,P＜0.05).此外,过氧化物酶增殖活化受体作为与脂代谢密切相关的细胞核受体基因,1∶1 n-6/n-3多不饱和脂肪酸低诱癌组较相应对照组上调PPARβ和PPARγmRNA表达力度明显弱于高乳腺癌诱发组.结论 不同膳食脂肪酸对PPAR基因表达的调节截然不同,这可能是差异性调节大鼠乳腺癌发生的分子机制之一.
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功能基因组学（functional genomics）
研究基因组功能表达的一门分支学科。研究的主要内容有：基因（包括疾病基因）的识别、鉴定和克隆（包括新策略、新技术、新方法的创立和各种基因组数据的建立）；基因结构与功能及其相互关系的研究（包括基因变异体的系统鉴定和目录的绘制、基因表达谱的编制、基因结构-功能关系的鉴定、基因相互作用网络图的编制及与防病治病相关的基因研究等）；基因表达调控的研究。
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高渗条件下RpoE与RpoS调节因子共同影响伤寒沙门菌生长代谢
目的 了解RpoE和RpoS调节因子在高渗应激下是否共同调节伤寒沙门菌的代谢生长.方法 运用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌rpoS/rpoE双缺失突变株,用PCR观察重组现象；以吸光度值(A600值)为纵坐标,培养时间为横坐标绘制生长曲线,观察细菌在高渗条件下的生存能力,分析其在对数生长早期(4 h)和对数生长晚期(12 h)的生长差异；利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和各基因缺失突变株代谢相关基因在高渗应激下的表达差异,选择部分差异表达基因利用实时定量RT-PCR进一步验证.结果 成功制备伤寒沙门菌rpoS/rpoE双缺失突变株.生长曲线分析发现,rpoS缺失突变株在生长4h和12 h的A600值分别为0.503±0.018和2.060±0.112,rpoE缺失突变株分别为0.293±0.053和1.933±0.115,rpoS/rpoE双缺失突变株分别为0.051±0.007和0.963±0.111,均低于野生株的0.725±0.097和2.496±0.171,差异具有统计学意义(P＜0.05).全基因组芯片筛选到42个受RpoE、RpoS调节的涉及代谢的基因.实时定量PCR结果发现,rpsE、rbsK、nusG、etuB在rpoS缺失突变株中的表达分别为(1.86±0.14)×106、(1.37±0.11)×106、(2.72±0.58)×106、(8.27±1.01)×106拷贝/μg,在rpoE缺失突变株中的表达分别为(2.19±0.17)×106、(1.51±0.12)×106、(2.73±0.57)×106、(9.63±1.42)×106拷贝/μg,与野生株中相应基因表达比较[分别为(1.94 ±0.10)×106、(1.52±0.11)×106、(2.39±0.52)×106、(10.83±1.52)×106拷贝/μg],差异无统计学意义(P＞ 0.05)；与rpoS/rpoE双缺失突变株比较[分别为(5.64±0.59)×106、(4.17±0.40)×106、(9.44±1.22)×106、(2.95±0.88)×106拷贝/μg],差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 RpoE与RpoS能够影响大量代谢相关基因的表达,共同调控伤寒沙门菌在高渗应激下的代谢生长.
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大鼠脊髓损伤后腓肠肌GDNF基因表达及意义
目的探讨大鼠脊髓损伤后,后肢肌GDNFmRNA表达的变化及其意义.方法选用SD雄性大鼠30只,根据脊髓损伤时间随机分为5组,即伤前、伤后3、7、10及21天组.采用Allens方法致大鼠脊髓T13段不完全性损伤,以β-Actin为内参照物,半定量RT-PCR方法,观察大鼠腓肠肌在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达.结果脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠腓肠肌微量表达,脊髓损伤后3天表达上调至3倍,7天上调至10倍,10天上调至4倍,21天仍高于正常水平.结论脊髓损伤后骨骼肌GDNFmRNA表达上调,可能是神经元通过"胞体-轴突-靶器官”途径的一种自我保护反应,用GDNF治疗脊髓损伤时应长期用药.
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河蚌提取物葡聚糖对软骨细胞Wnt通路的调控作用研究
目的：探讨河蚌肉提取物葡聚糖HBP-A（anodonta glucan HBP-A）对体外软骨细胞Wnt通路的调控作用。方法：体外培养大鼠软骨细胞，添加IL-1β（10 ng/ml）诱导分化，分为空白组，IL-1β组，IL-1β＋IWP-2（5μM，Wnt通路抑制剂）组，IL-1β＋HBP-A（0．3 mg/ml）组，IL-1β＋IWP-2＋HBP-A共5组培养，提取各组细胞RNA和蛋白，采用Rt-PCR 检测各组细胞 Wnt-3a、β-catenin （24、48、72 h）及 MMP-13（72 h）的基因表达；采用 Western-blot 检测β-catenin、MMP-13、Sox-9和Coll-Ⅱ蛋白的表达水平（48 h）。结果：细胞经IL-1β诱导分化，Wnt-3a基因表达升高，β-catenin以及MMP-13基因和蛋白表达升高，Sox-9和Coll-Ⅱ蛋白表达下调。添加HBP-A干预可以抑制IL-1β诱导下软骨细胞Wnt-3a基因的高表达、β-catenin以及MMP-13基因和蛋白的高表达，上调Sox-9和Ⅱ型胶原蛋白的表达。IWP-2和HBP-A合用时，Wnt-3a、β-catenin基因以及β-catenin蛋白表达低，Sox-9蛋白表达高。结论：HBP-A可通过降低Wnt/β-catenin信号通路表达，延缓软骨细胞分化，并且可与Wnt抑制剂协同调节Wnt-3a、β-catenin和Sox-9因子的表达。
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从经络的液晶体液模型到针刺的基因位点调控
在体液环境中,酶元的激活,即对酶分子链上各活性基团相对位置的调整之精度是纳米数量级的.如此之精度在液相环境内只有通过液晶排序才能实现.针刺影响内分泌的实质是"脏腑之气(内分泌)由先天之精气(基因)化生".当前人类基因组计划中大的难题就是对基因组功能的检测,面对天文数字的碱基对之排列组合,借助针灸等可影响内分泌的中医手段,可人为地引发各基因组合进入活动状态,将可能加快揭示生命之谜的进程.
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针刺对快速老化模型鼠脑中衰老相关基因表达的调整作用
目的:探讨针刺调整作用在分子水平的反映.方法:以快速老化模型鼠(SAM)脑中衰老相关基因的表达为研究对象,应用由磁珠分离法纯化mRNA,SMA RT-PCR cDNA合成和AFLP-银染法结合形成的mRNA-AFLP分析技术,进行mRNA指纹检测,寻找衰老相关性差异表达的基因片段,并观察针刺对其表达水平的影响.结果:随机应用20对引物作选择性AFLP扩增,共发现42条带型较为清晰的SAM P、R两系组间差异表达带,其中,33条(约占78.6%)在P系相对于R系低表达,9条(约占21.4%)在P系相对于R系高表达.针刺SAMP10的不同腧穴,可使异常低表达的基因表达水平不同程度地上调,使异常高表达的基因表达水平不同程度地下调,其变化均趋同于正常老化的SAMR1.结论:针刺对衰老机体紊乱的分子网络能发挥整体调节作用,促使其恢复协调平衡,从而延缓衰老进程.
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黄精多糖对高脂血症小鼠脂代谢相关基因mRNA及蛋白表达的影响
该文旨在研究黄精多糖对高脂血症小鼠脂代谢相关基因mRNA及蛋白表达的影响,将小鼠随机分为空白对照组,高脂血症模型组,辛伐他汀组,黄精多糖低、中、高剂量组(200,400,800 mg·kg-1 ·d-1),连续给药14 d后,腹腔注射75％新鲜蛋黄乳剂建立高脂血症小鼠模型.给药结束后测定血清中TC,TG,LDL-C,HDL-C的含量;采用Real-time PCR法测定肝脏组织中PPAR-α,PPAR-β,PPAR-γ,SREBP-1c,IL-6,TNF-α mRNA的表达水平;通过Western blot法分析检测黄精多糖对脂代谢相关基因(PPAR-α,PPAR-β,PPAR-γ,SREBP-1c,IL-6,TNF-α)蛋白表达的影响,以探讨黄精多糖的降血脂机制.实验结果表明,黄精多糖低、中、高剂量组均能降低血清中TC,TG,LDL-C的含量,以中、高剂量组多糖效果为显著(P＜0.01),同时,黄精多糖低、中、高剂量组均能升高血清中HDL-C的含量,以中、高剂量组多糖效果为显著(P＜0.01);此外,黄精多糖中、高剂量组可显著上调肝脏中PPAR-α,PPAR-β mRNA和蛋白表达量(P＜0.05),下调肝脏中PPAR-γ,SREBP-1c,IL-6,TNF-α mRNA和蛋白表达量(P＜0.05).以上研究表明黄精多糖具有抑制肝脏脂质氧化,调节与脂类代谢相关基因和蛋白表达的作用,进而起到防治高脂血症的功效.
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中药对中枢神经细胞基因表达影响的研究进展
随着生命科学的发展,尤其是分子生物学在各学科的渗入,使中医药实验研究深入到分子、基因水平.近年来,国内许多科研单位及学者已着手中药对神经细胞基因表达调控的研究,而且,现代药理研究表明,中药作用原理与其生物活性成分调控基因表达有关[1],本文就中药对中枢神经细胞基因表达的影响进行综述.
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单纯疱疹病毒Ⅱ型CTCF结合位点抑制启动子功能
为了找到CTCF在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)中的结合位点,并探讨其基因表达调控作用.对比HSV-1与HSV-2全基因组中CTCF结合序列区别;生物信息学分析HSV-2全基因组;Jaspar在线预测CTCF结合位点;依据CTCF结合的序列特点预测结合位置;PCR扩增预测位点并插入pGL3-promoter构建重组载体;重组载体转染人胚胎肾细胞(293T)双荧光检测验证预测位点转录调控效应.预测得到三个CTCF结合位点分别位于潜伏相关转录本(LAT)上游(CTUL)、下游(CTa'm)及内含子(CTRL)位置;扩增目的片段并构建重组载体,双酶切及测序验证成功;双荧光检测显示LAT内含子(pGL3-promoter-CTRL)及下游(pGL3-promoter-CTa' m)结合位点重组载体转染组与pGL3-promoter载体转染组相比,荧光强度明显减弱,差异有统计学意(P＜0.001),但与pGL3-basic组相比,并没有完全沉默荧光霉素的表达;上游结合位点重组载体(pGL3-promoter-CTUL)转染组与pGL3-promoter 相比无明显差异(P＞0.05).HSV-2 LAT序列内含子及下游序列上存在CTCF结合位点,具有减弱基因启动子功能的效应,可能在HSV-2维持潜伏中发挥作用.
关键词： 单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2) 潜伏复发机制 CTCF 基因表达调控
