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单纯疱疹病毒Ⅱ型CTCF结合位点抑制启动子功能
为了找到CTCF在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)中的结合位点,并探讨其基因表达调控作用.对比HSV-1与HSV-2全基因组中CTCF结合序列区别;生物信息学分析HSV-2全基因组;Jaspar在线预测CTCF结合位点;依据CTCF结合的序列特点预测结合位置;PCR扩增预测位点并插入pGL3-promoter构建重组载体;重组载体转染人胚胎肾细胞(293T)双荧光检测验证预测位点转录调控效应.预测得到三个CTCF结合位点分别位于潜伏相关转录本(LAT)上游(CTUL)、下游(CTa'm)及内含子(CTRL)位置;扩增目的片段并构建重组载体,双酶切及测序验证成功;双荧光检测显示LAT内含子(pGL3-promoter-CTRL)及下游(pGL3-promoter-CTa' m)结合位点重组载体转染组与pGL3-promoter载体转染组相比,荧光强度明显减弱,差异有统计学意(P＜0.001),但与pGL3-basic组相比,并没有完全沉默荧光霉素的表达;上游结合位点重组载体(pGL3-promoter-CTUL)转染组与pGL3-promoter 相比无明显差异(P＞0.05).HSV-2 LAT序列内含子及下游序列上存在CTCF结合位点,具有减弱基因启动子功能的效应,可能在HSV-2维持潜伏中发挥作用.
关键词： 单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2) 潜伏复发机制 CTCF 基因表达调控 -
CTCF在乳腺癌中的表达及其对细胞增殖的影响
目的：观察抑癌基因CTCF在乳腺癌细胞系、乳腺癌患者肿瘤组织及血清中的表达水平，并初步探讨其对乳腺癌细胞MCF7增殖的影响。方法 Western blot检测人乳腺癌细胞系MCF7、SKBR3和MDA-MB-231及正常乳腺细胞MCF-10 A中CTCF蛋白的表达。实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分别检测乳腺浸润性导管癌（ n＝23）、癌旁组织（ n＝10）及乳腺纤维腺瘤（ n＝10）中CTCF mRNA和蛋白水平的表达。酶联免疫吸附试验（ ELISA ）检测血清中CTCF的水平。进一步构建包装含CTCF的反转录病毒，感染MCF7细胞，筛选出稳定表达CTCF的细胞系， MTT法检测细胞的增殖。结果 CTCF在MCF-10A中表达高，MCF7、SKBR3和MDA-MB-231中逐渐降低。乳腺癌组织中CTCF表达显著低于癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织（ P＜0.01），CTCF在乳腺癌患者血清中表达量也显著低于健康对照（ P＜0.01）。 CTCF过表达能抑制MCF7细胞的增殖。结论 CTCF在乳腺癌细胞系、乳腺癌患者肿瘤组织及血清中表达降低。 CTCF可抑制乳腺癌细胞的增殖。
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肿瘤中胰岛素样生长因子Ⅱ基因印记及其丢失的机制
基因组印记(genomic imprinting)是目前肿瘤医学领域研究的新热点,印记基因胰岛素样生长因子Ⅱ基因(insulin-like growth factor 2,IGF2)与肿瘤相关性的研究也逐渐显现其参与肿瘤的发生、发展过程.IGF2是早发现的印记基因之一,对个体的生长发育起着重要的作用.近年发现大多数恶性肿瘤中都存在该基因的印记丢失所致的IGF2高表达现象,且IGF2印记丢失可以作为大肠癌等肿瘤发生危险性的分子标记,但肿瘤中IGF2印记形成和丢失的机制尚不清楚,本文将从等位基因差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)甲基化状态、绝缘蛋白CTCF(CCCTC-binding factor)结合能力及BORIS (brother of the regulator of imprinted sites)共同参与印记形成几个方面,阐述肿瘤中IGF2印记形成及其印记丢失的可能机制.
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CTCF过表达对乳腺癌细胞凋亡因子Bax和Bcl-2表达的影响
目的 探讨CTCF过表达对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中细胞凋亡因子Bax和Bcl-2表达的影响.方法 用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中CTCF、Bax和Bcl-2的表达.构建CTCF/pEGFP-N1过表达载体,用慢病毒转染法分别将CTCF/pEGFP-N1和空载质粒转入MDA-MB-231中,记作CTCF组和对照组.经RT-PCR鉴定CTCF成功转染MDA-MB-231后,采用实时定量PCR(Q-PCR)检测CTCF组和对照组MDA-MB-231中Bax和Bcl-2的mRNA表达,Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果 MDA-MB-231中不表达CTCF,表达Bax和Bcl-2.Q-PCR结果显示,CTCF组、对照组中Bax的mRNA表达水平分别为4.63±1.08和2.27±0.16,2组间差异有统计学意义(t=27.50,P<0.05);Bcl-2的mRNA表达水平分别为1.39±0.14和3.56±0.97,2组间差异有统计学意义(t=39.00,P<0.05).Western blot结果显示,CTCF组中Bax蛋白表达水平高于对照组,Bcl-2蛋白水平低于对照组.ELISA结果显示,CTCF组和对照组中Bax蛋白表达水平分别为15.25±2.17和6.24±1.78,2组间差异有统计学意义(t=26.84,P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平分别为4.59±0.97和10.68±1.93,2组间差异有统计学意义(t=21.72,P<0.05).结论 CTCF过表达可促进乳腺癌细胞中凋亡因子的表达,抑制抗凋亡因子的表达.
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GST-CTCF 融合蛋白原核表达载体的构建及表达
目的：构建人 CCCTC 结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）与谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transfer-ase，GST）重组蛋白的原核表达载体，并进行诱导表达。方法以 pEASY-T1-SIMPLE-CTCF 为模板，设计引入限制性酶切位点的 CTCF 引物，PCR 方法扩增目的片段，产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体 pGEX-4T-1连接，构建成 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达载体，转化至大肠埃希菌 BL21中，经异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）进行诱导，Western blot 检测 GST-CTCF 融合蛋白的表达情况。结果经菌液 PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒 pGEX-4T-1-CTCF 构建成功，GST-CTCF 融合蛋白产物经 Western blot 鉴定为特异性表达。结论成功构建了 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达质粒，获得特异性的 GST-CTCF 融合蛋白，为进一步研究转录因子CTCF 的功能奠定了基础。
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CTCF在人类疱疹病毒潜伏复发机制中的调控作用
疱疹病毒家族是一类具有包膜结构的双链DNA病毒,是人类病毒性疾病常见的病原体.目前已经鉴定的人类疱疹病毒共有8种,分为α、β、γ三个亚科,8种疱疹病毒所引起的临床表现各不相同,但均可在宿主体内建立长期潜伏感染,并在潜伏感染过程中可出现再激活,再致病.CTCF结合因子作为重要的多功能转录因子,是表观遗传学调控的重要作用因子,可调控多种靶基因的表达.目前研究提示,在多种人类疱疹病毒潜伏的建立及再激活过程中,CTCF发挥着重要的作用,本文就CTCF在人类疱疹病毒潜伏复发机制中的调控作用作一综述.
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人CTCF N端融合蛋白的表达、抗体制备及鉴定
为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N 端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析.采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-CTCF N融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.并通过Western blot,对肿瘤细胞和组织CTCF蛋白表达状态进行初步分析.本实验成功在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST-CTCF N 融合蛋白,经亲和层析纯化获得了纯化的融合蛋白.免疫新西兰大白兔获得了较高生物活性和特异性的多克隆抗体,Western blot证实此多克隆抗体能够特异性识别HepG2、 HeLa、 MCF-7癌细胞及组织的内源性CTCF蛋白,为今后从蛋白质水平研究CTCF基因表达调控研究打下了基础.
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转录因子CTCF对人肝癌干细胞及细胞增殖的影响
目的 探讨CCCTC结合因子(CTCF)蛋白对人肝癌细胞(HepG2)的肿瘤干细胞的影响以及对HepG2和CNE1(鼻咽癌细胞系)细胞生存能力的影响.方法 构建pEGFP-N1/CTCF、CTCF shRNA和GFP-shRNA质粒,转染至HepG2和CNE1细胞后,以RT-PCR及Western blot检测CTCF mRNA和蛋白的表达.采用流式细胞术检测转染CTCF-shRNA质粒后48 h的HepG2细胞中携带表面抗原CD90肿瘤干细胞的比例,以转染GFP-shRNA的HepG2细胞和野生型HepG2细胞为对照.采用MTT方法分别检测转染CTCF过表达重组质粒及CTCF-shRNA质粒后24、48、72 h HepG2和CNE1细胞的生存能力.结果 pEGFP-N1/CTCF转染后增加HepG2和CNE1细胞中CTCF mRNA和蛋白的表达(与pEGFP-N1相比,P＜0.05),CTCF-shRNA转染则降低表达(与GFP-shRNA相比,P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,CD90+细胞的检出率在转染CTCF-shRNA质粒细胞[(1.733 0±0.417 7)％]高于野生型HepG2细胞[(0.575 0±0.062 9)％]及转染对照GFP-shRNA质粒细胞[(0.350 0±0.086 6)％] (P＜0.05);MTT实验结果显示CTCF的表达改变对HepG2和CNE1细胞的生存能力的影响不明显(P＞0.05).结论 CTCF可抑制人肝癌干细胞生成,对HepG2和CNE1细胞生长无明显影响.
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同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞CTCF表达的影响
目的 以动脉粥样硬化(AS)的独立危险因子同型半胱氨酸(Hcy)处理人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs),观察Hcy对VSMCs多价核因子CTCF表达的影响;探讨Hcy致AS发病的可能机制.方法 将培养的VSMCs分为0、50、100、200、500及1000 μmol/L Hcy处理组,以0 μmol/L Hcy组为空白对照.在VSMCs覆盖瓶底70%时,将不同浓度的Hey加入培养液,继续培养VSMCs 48 h,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学方法 分别检测VSMCsCTCF的mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照组比较,Hcy刺激48h后,VSMCsCTCF的mRNA和蛋白表达皆明显增加,以高浓度组为著(500、1000μmol/L Hcy,P<0.05).CTCF免疫组织化学阳性染色以细胞核为主.结论 Hcy升高可诱导VSMCs CTCF的表达上调.
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染色质相互作用研究进展
真核生物的染色体如何发生复杂构象变化并组织成复杂的高级结构,仍是一个研究热点.染色体的这些结构特征和构象变化可通过了解染色质位点间的相互作用,即利用染色体(质)构象捕获(3C)及其衍生技术,如4C、5C、Hi-C和ChIA-PET等技术来研究.利用这些技术,已得到一些有关染色质相互作用与基因表达调控和细胞核内染色体组织结构的重要信息.如利用ChIA-PET技术,发现雌激素受体、RNA聚合酶Ⅱ、CTCF等一些转录因子都参与了染色质的长程相互作用,并同时在基因组水平鉴定了特定细胞中的一些相应的有调控潜能的DNA元件及其可能的调控基因.利用Hi-C及其他3C衍生技术,不但表明染色体在细胞核内占据着不同的染色体领域,而且发现染色体上有次级结构域如染色体区隔和染色体拓扑联合域.随着相关技术的完善和更多数据的获得,分析和整合这些数据将对生物信息学家提出更高的要求,同时也可以帮助我们更进一步了解染色体三维构象变化在不同环境下的变化规律,以及在基因转录调控、DNA复制和修复等重要过程中的作用.
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CTCF通过ALAS2调控K562细胞红系分化
目的 研究CTCF对红系分化的影响及相应调控机制.方法 敲低K562细胞中的CTCF,通过Hemin诱导和荧光实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术,分析Hemin诱导0到4天的对照和CTCF敲低细胞的珠蛋白基因表达水平,研究CTCF敲低对红系分化的影响.利用基因表达芯片全基因组范围分析CTCF敲低造成的影响.根据公共数据分析推测CTCF调控红系分化的潜在机制,通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证.结果 随着诱导的进行,对照和敲低细胞中的珠蛋白基因HBE和HBG表达均逐渐升高,但CTCF敲低细胞中HBE和HBG基因水平均低于对照细胞,提示CTCF敲低能够抑制K562细胞分化过程中珠蛋白基因的表达.通过检测全基因组范围的基因表达水平,共筛选到1 128个差异表达基因,其中616个基因在CTCF敲低样本中表达上调,512个基因表达下调.利用IPA软件进行功能富集分析,显示主要相关的生理系统发育与功能包括血液系统的发育与功能.公共数据显示存在CTCF-GATA1-ALAS2作用关系,ALAS2基因上存在GATA1结合;对照和CTCF敲低细胞的ChIP-qPCR结果表明,敲低CTCF能够降低GATA1在ALAS2基因区的结合.结论 CTCF可能通过影响GATAI在ALAS2基因区的结合来调控K562细胞红系分化.
