包涵体变复性技术研究进展

现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组蛋白药物的研发.目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在.与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜.因此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一.

基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术

抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品,其特异性高、均一性好、靶点明确,广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗[1-2].目前,在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中,肿瘤类疾病占32%、免疫性疾病占37%、器官移植疾病占11%、感染性疾病占8%、心血管疾病占4%、其他疾病占6%.

人雌激素受体ERα/ERβ在大肠杆菌中的表达

雌激素主要通过与雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合而发挥作用,ER是一类有配体激活的核转录因子.ER分为ERα和ERβ两种亚型,它们在人体内具体表达部位不同,发挥的功能也有所不同.ERα(GenBank登录号:BC128573)蛋白含595个氨基酸,ERβ(GenBank登录号:NM_001437)蛋白含530个氨基酸,为核受体超家族成员.无论哪种亚型的ER,一旦配体与之结合,ER即形成二聚体,并与雌激素应答元件(estrogen responsive element,ERE)结合,从而激活ERE调节的靶基因,进而招募辅激活子或辅抑制子来激活或抑制靶基因的转录表达.

小鼠胆盐依赖脂肪酶蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备

目的 构建小鼠胆盐依赖脂肪酶(BSDL)重组蛋白的大肠埃希菌原核表达载体,制备具有生物学活性的小鼠BSDL蛋白.方法 首先应用PCR合成mBSDL的cDNA序列,克隆至原核表达载体pET-28b,转化大肠埃希菌表达菌种BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达.使用His Trap FF crude柱纯化重组mBSDL蛋白.Western blot鉴定后采用尿素浓度梯度降低法进行透析复性.结果 成功构建原核表达载体pET-28b-mBSDL,实现该蛋白在E.coli BL21 (DE3)表达菌种中的高效表达,并且表达蛋白主要存在于包涵体中.Western blot示获得较好的纯化效果且纯化后成功复性.结论 成功构建mBSDL基因的原核表达质粒并制备具有活性功能的胆盐依赖脂肪酶,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.

转移相关基因ABCE1编码蛋白的表达及鉴定

目的 构建谷胱甘肽S―转移酶(GST)标签的ATP结合盒转运子E1(ABCE1)基因的原核表达载体pGEX―4T―1―ABCE1,通过转化技术,诱导GST―ABCE1重组蛋白表达.方法 通过基因克隆技术构建融合ABCE1基因的原核表达载体,经酶切和测序等方法进行检测.通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导GST―ABCE1重组融合蛋白表达.经酶切,Western blot和质谱测序等方法对该重组蛋白进行鉴定.结果 ABCE1基因片段成功插入pGEX―4T―1原核表达载体中,双酶切和测序后,经GenBank blast比对验证,证实ABCE1基因插入载体部位正确,碱基序列正确.凝血酶酶切检测重组蛋白GST―ABCE1得到72000大小的特异条带,该条带可以被ABCE1抗体识别,质谱检测得到ABCE1蛋白的特异性序列,该序列评分138分(P<0.05).结论 pGEX―4T―1―ABCE1原核表达载体质粒构建成功,并成功诱导GST―ABCE1重组蛋白表达,为继续研究ABCE1在肺癌中的作用机制奠定基础.

肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域研究

目的 明确肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域.方法 通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达前期研究获得的表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55,获得GST-ABCE1-55重组融合蛋白表达,应用GST pull-down的方法验-pGEX-4T-1-ABCE1-55与β-肌动蛋白有无相互作用.结果 GST-ABCE 1-55是带有GST标签的含有357个氨基酸的重组蛋白,大小约66×103,在GST pull-down实验中,GST-ABCE1-55并不能与β-肌动蛋白特异结合.结论 肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域应位于ABCE1蛋白第358位至第600位编码氨基酸中.

028婴儿利什曼原虫GRP94同源基因的克隆、重组蛋白表达及抗原性分析

TAZ原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过PCR方法扩增心磷脂酰基转移酶全长基因tafazzin,将其插入到原核表达载体pEASY中.经菌落PCR筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pEASY-TAZ构建成功.将pEASY-TAZ分别转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS和Transetta (DE3)中,以不同浓度的IPTG在不同温度条件下诱导TAZ蛋白表达,选择蛋白表达量较高的Transetta (DE3)菌株作为工程菌.结果显示,重组蛋白表达量随IPTG浓度的提高而增加;温度对TAZ蛋白原核表达有重要影响,低温条件(16℃)可以提高重组蛋白的可溶性.经Western blot试验证实重组蛋白TAZ表达成功.

恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域的表达及活性鉴定

目的:构建杆状病毒昆虫表达质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd和无细胞麦胚表达载体pEU-His-set7cd,表达恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域(PfSET7cd),并鉴定PfSET7cd的组蛋白甲基转移酶活性.方法:通过分子克隆技术构建获得pFast-N/C-set7cd以及pEU-His-set7cd表达质粒,尝试通过杆状病毒传代方式与无细胞麦胚表达方式获得重组PfSET7cd蛋白,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,并进一步检测重组蛋白的酶活性.结果:用于昆虫表达的重组质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd双酶切结果大小与测序结果均正确,但是Western blot并未检测到其在昆虫细胞中的可溶性表达产物;pEU-His-set7cd通过无细胞麦胚表达系统表达获得的蛋白与预测大小一致,经Western blot鉴定正确,并用NTA-Ni2+亲和层析纯化.体外酶活实验显示PfSET7cd具有催化H3第36位赖氨酸上三甲基化(H3K36me3)活性.结论:通过无细胞表达系统获得可溶性的PfSET7cd重组蛋白,PfSET7cd重组蛋白具有介导H3K36me3的活性,但不影响H3K4me3和H3K9me3水平.

登革病毒重组蛋白表达及其亚单位疫苗研究进展

登革病毒(DV)为黄病毒属的重要成员,借蚊媒传播而引起登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS),其基因组全长约为10.7kb,编码有C-prM/M-E3个结构蛋白和7个非结构蛋白.

GST-gAD在大肠杆菌中的优化表达及其生物活性测定

目的 探讨可溶性重组脂联素球状结构域融合蛋白(GST-gAD)在大肠杆菌中的优化表达及其抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的生物学活性.方法 用含有GST-gAD基因的原核表达载体pGEX-KG-gAD转化E.coli JM109,同理空载质粒pGEX-KG作为内对照同时转化E.coli JM109;将影响融合蛋白表达的4个因素,温度、IPTG浓度、细菌密度OD600和诱导时问进行正交设计.确定其优化表达条件,用亲和层析法纯化GST-gAD;用MTT法检测GST-gAD对MDA-MB-231增殖的影响.结果 GST-gAD佳表达条件为温度32℃,IPTG的浓度1.0 mmol/L,诱导前细菌密度OD6001.0,诱导表达时间1.5 h.GST-gAD浓度高于0.5μmol/L时对MDA-MB231细胞的生长具有明显的抑制作用.结论 通过正交设计确定了可溶性GST-gAD融合蛋白在大肠杆菌中表达的优化条件并且当重组融合蛋白在大于0.5μmol/L时对MDA-MD231细胞的生长具有明显的抑制作用.

GST-CTCF 融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的：构建人 CCCTC 结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）与谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transfer-ase，GST）重组蛋白的原核表达载体，并进行诱导表达。方法以 pEASY-T1-SIMPLE-CTCF 为模板，设计引入限制性酶切位点的 CTCF 引物，PCR 方法扩增目的片段，产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体 pGEX-4T-1连接，构建成 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达载体，转化至大肠埃希菌 BL21中，经异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）进行诱导，Western blot 检测 GST-CTCF 融合蛋白的表达情况。结果经菌液 PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒 pGEX-4T-1-CTCF 构建成功，GST-CTCF 融合蛋白产物经 Western blot 鉴定为特异性表达。结论成功构建了 pGEX-4T-1-CTCF 原核表达质粒，获得特异性的 GST-CTCF 融合蛋白，为进一步研究转录因子CTCF 的功能奠定了基础。

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的 制备阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位.方法 将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coli M15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹Western Blot鉴定抗血清.采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位.结果 Western Blot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网.结论 获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网.

阴道毛滴虫肌动蛋白cDNA克隆与表达

目的 克隆阴道毛滴虫肌动蛋白基因片段,表达及纯化肌动蛋白重组蛋白,免疫豚鼠获得抗血清,为进一步研究肌动蛋白在阴道毛滴虫体内定位及其在细胞衰老过程中的作用奠定基础.方法 应用PCR方法获得阴道毛滴虫肌动蛋白基因部分片段,并克隆入表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,IPTG诱导重组质粒表达,亲和层析纯化表达产物,Brandford法测定重组蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定.结果 肌动蛋白基因的PCR产物片段大小500 bp;构建了阴道毛滴虫肌动蛋白基因重组表达质粒;表达了肌动蛋白重组蛋白;SDS-PAGE显示分离纯化的肌动蛋白重组蛋白为47000 u;Western-blot结果表明所获得抗血清可与肌动蛋白重组蛋白在47000 u及阴道毛滴虫总蛋白在41000 u处特异性反应.结论 重组肌动蛋白获得高效表达,其免疫豚鼠获得的抗血清可与阴道毛滴虫肌动蛋白重组蛋白反应,也可识别阴道毛滴虫虫体肌动蛋白,该抗血清可用于进一步的研究.

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能.方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1a cDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定.结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25 bp大小的内含子.成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质.结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25 bp的内含子.获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究.

重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达条件的优化

目的:优化含PKCε催化功能域基因的重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达的佳条件.方法:含重组质粒大肠杆菌培养、表达产物的SDS-PAGE电泳及Western blot检测.结果:PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达的佳条件为:含重组质粒大肠杆菌过夜培养时加入0.1%的葡萄糖增加质粒拷贝数;诱导剂(IPTG)的适工作浓度为0.5 mmol/L;诱导适培养温度为30℃;诱导培养时间为2～3 h用于检测,6～24 h用于分离纯化.结论:PKCε催化功能域在大肠杆菌中成功表达,为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫.