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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白基因片段的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(SARS)病毒为冠状病毒科.该病毒主要引起以破坏呼吸道肺上皮细胞为主的全身性疾病,引发免疫抑制和全身感染.同时,SARS病毒感染与全身血管病变有关.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,表达了SARS冠状病毒S1蛋白的C端部分,此区域包含主要中和抗原位点[1].利用原核表达系统快速高效的特点,可以迅速表达重要的新病原活性蛋白,为进一步建立特异性诊断方法、疫苗动物试验、中和抗体诱导、基因工程疫苗的研制提供实验手段和依据.同时也为疫苗研究提供了新的战略思路.
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包涵体变复性技术研究进展
现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组蛋白药物的研发.目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在.与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜.因此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一.
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重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究
我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路.由于长片段目的基因在原核系统中不易表达,根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达,第一部分为N-1蛋白1~549 bp,第二部分为N-2蛋白496~1269 bp,上下游分别设计BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点,并将基因中包含这两种酶切位点的基因以无义读码方式进行突变,通过全基因合成分别将两段基因克隆至原核表达载体pET32a(+),由上海生工生物工程技术公司完成,测序证实序列无误.
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幽门螺杆菌临床分离株flaA和flaB基因的克隆、表达和鉴定
所有幽门螺杆菌(Hp)菌株均有鞭毛,由染色体基因组中的flaA和flaB两个基因编码,全长分别为1 533bp和1 545bp,其核苷酸或氨基酸序列高度保守,与其它细菌鞭毛蛋白无抗原交叉,多数Hp感染者血清中可出现FlaA和FlaB抗体[1],因而FlaA和FlaB可作为基因工程疫苗和诊断试剂盒的候选抗原.我们构建了Hp临床菌株Y06的高效原核表达系统,鉴定了重组FlaA(rFlaA)和重组FlaB(rFlaB)抗原性和免疫反应性,检测了Hp临床分离菌株FlaA、FlaB抗原表达和感染者血清抗体情况.
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幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定
已发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)疫苗具有预防和治疗Hp感染的效果[1].大多数Hp菌株均能产生空泡毒素(vacuolating cytotoxin, vacA),其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量(Mr)约87×103的VacA被转运到细胞外,Mr为4×103氨基末端信号肽和50×103羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中[2].Hp感染者血清中可出现VacA抗体,重组VacA在Hp SS1株小鼠感染模型中有80%的保护率[3].我们构建了vacA原核表达系统,所表达的重组VacA可作为Hp基因工程疫苗的候选抗原.
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GⅡ.4型诺如病毒GZ121株P蛋白的表达及其结合HBGA受体特征
目的 建立我国流行优势株GⅡ.4型诺如病毒(GZ121)P蛋白(包括P颗粒和P二聚体)的原核表达系统,并明确其结合HBGAs受体的能力和方式.方法 从GⅡ.4型诺如病毒GZ121株基因组中克隆P区域基因片段,通过构建P区域氨基酸序列进化树,确定其基因簇.构建含铰链Hinge-P和不含铰链P-CDCRGDCFC的pGEX4T-1原核表达质粒,将构建的原核表达载体导入大肠杆菌(E coliBL21,用0.6 mmol/L IPTG(isoProPylthio-β-D-galaetoside)过夜诱导P颗粒(不含铰链)和P二聚体(含铰链)在BL21中表达.目的重组蛋白经溶血酶酶切和FPLC鉴定分析,用EIA法检测P颗粒和P二聚体与HBGAs的结合特征.结果 GZ121株诺如病毒为GⅡ.4基因型2004簇(GⅡ.4/2004 cluster).SDS-PAGE分析确定P颗粒和P二聚体相对分子质量(Mr)约为36×103,大小与报道相符.重组P颗粒经FPLC证实,其在Mr约为830×103处形成特异的P颗粒波峰,Western blot技术证实了重组P蛋白的特异性.EIA分析结果表明,GZ121株P蛋白与A、B、O型唾液均能结合,与非分泌型唾液不结合,而P颗粒结合HBGAs受体能力是P二聚体的80~ 100倍,与96簇VA387 P颗粒相比,其结合O型能力增强,而结合A型能力稍弱.结论 我国优势流行株GⅡ.4型诺如病毒P蛋白的表达成功及其与HBGAs受体结合模型的建立,为今后研究我国诺如病毒的流行进化规律及疫苗的开发研究奠定了实验基础.
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LTB-hpaA融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性鉴定
黏附素(HpaA)是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)鞭毛鞘膜蛋白,几乎存在于所有的Hp菌株表面,序列高度保守,可作为基因工程疫苗的候选抗原.本文构建了ltB-hpaA融合基因原核表达系统pQE32-ltB-hpaA-E.coli M15,并用SDS-PAGE、Western blot和GM1-ELISA分别证实了LTB-HpaA重组蛋白(rLTB-hpaA)表达和免疫性.
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肌钙蛋白Ⅰ(28~110aa)-C复合物的表达纯化及抗体制备
心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是诊断急性心肌梗死的"金标准"[1-2].心肌损伤时,外周血中90%以上的cTnI以I-C复合物形式存在[3-4],而28~110间的肽段与C形成复合物稳定,我们根据患者血清中cTnI存在形式,通过引物设计构建pGEX4T-3-cTnI(28~110aa)-C原核表达系统,在大肠杆菌中实现cTnI(28~110aa)-C复合物的稳定可溶性高表达.然后,用该融合蛋白抗原制备抗cTnI单克隆抗体及多克隆抗体,为建立检测方法,提高检测灵敏度做前期准备.
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BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白的研究
该重组抗菌蛋白是采用基因工程技术研制的一种由杀菌/渗透增强蛋白功能性N端片段(BPI23)与IgGlFc片段(Fcγ1)嵌合而成的抗感染生物制剂.目前该课题已取得关键性研究成果,即采用原核表达系统成功地获得了具备BPI和IgG双重功能的非糖基化抗菌蛋白.体外初步研究证实,该重组蛋白不仅具有杀伤G-菌及中和内毒素的作用,而且兼备激活补体和调理作用.
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重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立
目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达.方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western Blot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性.结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512 bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,Western Blot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8~2)×108U/mg.结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b.
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大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展
大肠杆菌表达系统因为其遗传背景清楚,低成本,高生产率,特征明确,兼容多种抗体[1]使之成为目前常用的外源蛋白原核表达系统.近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术.采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力.然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到大限度的提高与产率较低等问题.因此本文将就外源基因本身特性对于高效表达的影响,表达系统的特性对于高效表达的影响,外源基因与系统间的相互作用及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素.终总结出一套高效表达的策略.
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人乳头瘤病毒11型L1基因原核表达系统的构建及鉴定
目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1原核表达系统pBAD(B)-HPV11L1,表达HPVL1蛋白,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.方法PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型L1基因片段,克隆至pBluescript质粒,并测序.将其从克隆重组质粒中切下连入表达载体,建立pBAD(B)-HPV11L1原核表达重组质粒,在大肠杆菌宿主菌Top10中,经阿拉伯糖诱导,表达融合蛋白L1,经SDS-PAGE电泳和Western blot进行鉴定.结果3株HPV11L1经测序发现变异一致,每株均有2个核苷酸变异,但未影响氨基酸变化.经SDS-PAGE鉴定L1蛋白相对分子质量为59×103,与预期值相同,Western blot证明表达蛋白能与单克隆抗体反应,成功构建了pBAD(B)-HPV11L1原核表达系统.结论所构建的pBAD(B)-HPV11L1原核表达系统能够高效表达HPV11L1蛋白.
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乙型肝炎病毒X基因的克隆与鉴定
目的 构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,以进一步研究其基因产物的功能及致病机制.方法 以肝炎患者血清DNA为模板,用PCR方法扩增乙型肝炎病毒X基因,构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,经酶切电泳验证重组质粒的正确性,并对X基因进行测序鉴定.结果 PCR结果显示,扩增片断大小约465 bp,与预期相同.重组质粒经酶切电泳判断有目的片段插入,方向正确,经测序证实插入片段是乙型肝炎病毒X基因,编码框无误.结论 成功构建乙型肝炎病毒X基因重组质粒pQE30-HBx.
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HPV 1 6 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化
目的建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法,纯化目的蛋白.方法构建pGEX4T-HPV16L1表达质粒.在大肠杆菌BL21表达系统中表达,经过包涵体提取,8mol/L尿素溶解,分级透析除去尿素,亲和层析进行提纯.结果 HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在,通过本方法可以获得纯化的蛋白.结论建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法.为研究HPV16L1的应用研究打下了基础.
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乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究
目的克隆乳腺珠蛋白(human mammaglobin,hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法.方法自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcDNA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97%的目的蛋白.结论成功地纯化出hMAM重组蛋白.
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华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较
目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果.方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因,与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a-CP和真核表达质粒pPIC9K-CP,双酶切及测序鉴定后,将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中诱导表达、纯化;将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清,比较诊断效果.结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在,表达量为6.84mg/L;真核表达系统表达量达到65.00mg/L,且为可溶性蛋白;两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00% (57/60)和93.30% (56/60),特异性分别为91.67%(77/84)和94.10%(79/84),差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值.
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人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析
目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据. 方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(rLYZL4)表达.分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性.以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位. 结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性.制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上. 结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关.
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人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化
目的:克隆人乳珠蛋白(hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础.方法:自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcD-NA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果:乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型,即hMAM和hMAM(Isoform),长度分别为279和270bp,两者相差9个连续碱基,其翻译产物相差3个连续氨基酸残基;表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97%的目的蛋白.结论:获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体;融合蛋白的表达及纯化成功.
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人肝再生增强子原核表达系统的构建与筛选
目的 构建多个人肝再生增强子(hALR)的原核表达系统进行原核表达、鉴定及筛选,得出理想的系统用于进一步的研究.方法 构建4个重组表达质粒pET28a(+)/hALR、pET23a/hALR、pGEX-5x-1/hALR、pGEX-5x-2/hALR,分别转化3种宿主菌,诱导表达重组hALR蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westem blotting鉴定重组蛋白.结果 双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入4种表达载体并成功转化宿主菌,仅pET28a(+)/hALR的BL21(DE3)菌株成功表达相对分子质量为23kDa的重组蛋白.结论 筛选得出人肝再生增强子的原核表达系统,成功表达并鉴定重组hALR蛋白.
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重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定
目的利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin,并对其进行生物学活性鉴定.方法采用RT-PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA,将其克隆入pGEM-T Easy 克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450-1,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定.结果成功获得549bp人 endostastin 基因,测序证实序列正确.经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带.重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间.结论人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础.