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诺如病毒感染宿主免疫应答的研究进展
诺如病毒是引起非细菌性急性感染性胃肠炎的主要病原体,常常引起严重的公共卫生与食品安全问题.诺如病毒疫苗的研发被越来越多的国家提上日程,疫苗的研制和应用依赖于对宿主和病毒相互关系的深入了解,依赖于宿主对病毒的免疫应答机制的了解.本文综述了诺如病毒国内外流行现状、诺如病毒感染与HBGAs受体关系和诺如病毒感染人或动物后机体的免疫应答研究现状.
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GⅡ.4型诺如病毒GZ121株P蛋白的表达及其结合HBGA受体特征
目的 建立我国流行优势株GⅡ.4型诺如病毒(GZ121)P蛋白(包括P颗粒和P二聚体)的原核表达系统,并明确其结合HBGAs受体的能力和方式.方法 从GⅡ.4型诺如病毒GZ121株基因组中克隆P区域基因片段,通过构建P区域氨基酸序列进化树,确定其基因簇.构建含铰链Hinge-P和不含铰链P-CDCRGDCFC的pGEX4T-1原核表达质粒,将构建的原核表达载体导入大肠杆菌(E coliBL21,用0.6 mmol/L IPTG(isoProPylthio-β-D-galaetoside)过夜诱导P颗粒(不含铰链)和P二聚体(含铰链)在BL21中表达.目的重组蛋白经溶血酶酶切和FPLC鉴定分析,用EIA法检测P颗粒和P二聚体与HBGAs的结合特征.结果 GZ121株诺如病毒为GⅡ.4基因型2004簇(GⅡ.4/2004 cluster).SDS-PAGE分析确定P颗粒和P二聚体相对分子质量(Mr)约为36×103,大小与报道相符.重组P颗粒经FPLC证实,其在Mr约为830×103处形成特异的P颗粒波峰,Western blot技术证实了重组P蛋白的特异性.EIA分析结果表明,GZ121株P蛋白与A、B、O型唾液均能结合,与非分泌型唾液不结合,而P颗粒结合HBGAs受体能力是P二聚体的80～ 100倍,与96簇VA387 P颗粒相比,其结合O型能力增强,而结合A型能力稍弱.结论 我国优势流行株GⅡ.4型诺如病毒P蛋白的表达成功及其与HBGAs受体结合模型的建立,为今后研究我国诺如病毒的流行进化规律及疫苗的开发研究奠定了实验基础.
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GⅡ-4型诺如病毒体外结合唾液HBGAs受体的检测与分析
目的 建立诺如病毒(Norovirus, NoV)结合唾液HBGAs受体的实验方法 、验证2株GⅡ-4型NoV毒株与我国人群唾液HBGAs的结合方式.方法 收集健康志愿者唾液标本,采用凝集抑制实验法检测唾液中HBGAs血型物质,用EIA法检测NoV VLPs、阳性毒株与HBGAs的结合情况.结果 63份标本检出O型21例(占33.3%),B型14例(占22.2%),A型和非分泌型各13例(分别占20.6%),AB型2例(占3.2%).rVA387、2株GⅡ-4型毒株均能结合分泌型,与非分泌型唾液不反应.结论 本研究成功建立了NoV结合唾液HBGAs受体的实验方法 ,通过NoV毒株与HBGAs相互作用的研究有助于了解NoV的宿主适应特性及病毒进化和流行规律;同时为筛选防治我国人群的抗NoV药物提供技术平台.
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诺如病毒病毒样颗粒的表达及其与HBGAs受体的结合研究
目的:以杆状病毒为载体,在昆虫细胞sf9中表达GⅡ-4型野生株诺如病毒(Norovimses,NOV)GZ121的衣壳蛋白ORF2,并验证其与组织血型抗原(Histoblood group antigen,HBGAs)受体的结合活性.方法:双酶切质粒PMD18-T-GZ121 ORF2酶切,连接人线性化载体PFastBacTM1,获得重组转座载体pFastBac-GZ121 ORF2,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得重组杆状病毒,将其转染昆虫sf9细胞进行蛋白表达,用蔗糖超离方法纯化以及免疫印迹、透射电镜等方法鉴定表达产物,用EIA法检测NOV-VLP与HBGAs的结合特性.结果:成功表达了分子量约为58 kD的NoV衣壳蛋白,大小约30 nm与预期相符,NOV-VLP与A、B、O型均能结合,与非分泌型唾液不结合,结合方式与rVA387相一致.结论:我国优势流行株GⅡ4型NoV病毒样颗粒(Vires-like particles,VLP)的表达成功及NoV-VLP和HBGAs受体结合模型的建立,为我国NoV疫苗的开发和防治药物的研究奠定了基础.
