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病毒样颗粒技术的研究进展
病毒样颗粒( Virus-like Particles,VLPs),也称为核心样颗粒( Core-like Particles,CLPs),是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的介于15nm～400nm的空心蛋白颗粒[1].形态上,VLPs类似未成熟的病毒粒子,但由于缺乏调节蛋白和感染性核酸而无复制和感染能力,不存在感染宿主的危险性.但VLPs具有天然病毒的类似嗜性,能高密度地展示病毒抗原表位,通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,引发强有力的特异性体液和细胞免疫,有效诱导机体的免疫系统产生免疫应答[2].
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甲型肝炎疫苗研究进展
甲型肝炎(简称“甲肝”)是由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的一种急性传染病,主要经粪-口途径传播,四季均可发生.甲肝容易发生大规模的暴发,其流行程度因世界各地不同的卫生条件、社会经济水平而存在着显著差异[1].目前,世界范围内使用多的甲肝疫苗为甲醛灭活疫苗和减毒活疫苗,两种甲肝疫苗均有良好的接种效果[2].本文就甲肝疫苗的研究现状、HAV分子的新发现及对新型疫苗的研究进展予以综述.
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病毒样颗粒疫苗的研究现状
病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构,是由某些病毒的部分结构蛋白过度表达[1]时在细胞内自行组装而成.VLPs与它的源病毒颗粒和亚病毒颗粒(SVPs)有着类似的抗原性,因此VLPs作为候选疫苗是很具潜力的.本文就VLPs作为新一代疫苗的发展现状以及应用潜力加以综述.
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多瘤病毒样颗粒的制备及血清学检测方法的建立
目的 制备多瘤病毒(John Cunningham virus,JCV)病毒样颗粒并建立JCV血清学检测方法,了解我国一般人群JCV流行情况.方法 通过基因合成技术合成JCV衣壳蛋白基因VP1,将其克隆至PET-21a质粒,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,IPTG诱导表达,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定目的蛋白表达.采用2次超速离心法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE、透射电子显微镜及血凝试验鉴定纯化产物.以纯化产物为抗原建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法,筛查一般人群血清标本,分析该人群JCV感染情况.结果 通过透射电子显微镜观察及血凝试验鉴定,显示纯化产物具有和天然JCV颗粒类似的形态结构和血凝活性.以纯化的JCV病毒样颗粒为抗原建立了间接ELISA法,筛查了一般人群抗JCV IgG抗体,结果显示一般人群抗JCV IgG抗体阳性率为54.2％.结论 本研究制备了JCV病毒样颗粒,所建立的ELISA法可应用于JCV人群血清流行病学调查.
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哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定
目的 利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(W NV) prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础.方法 筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定.结果 重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(virus like particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体.结论 在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础.
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补益类复方中药调控流感病毒样颗粒免疫小鼠外周血白细胞介素17 A的表达水平
目的：探讨补益类复方中药对流感病毒样颗粒( virus-like particles,VLPs)免疫小鼠外周血白细胞介素17A(interleukin 17A,IL-17A)表达的影响。方法将42只BALB/C小鼠随机分为VLPs组、VLPs+益气方组、VLPs+补血方组、VLPs+滋阴方组、VLPs+壮阳方组、VLPs+霍乱毒素组和PBS组共7组,每组6只,分别于0和14天通过鼻腔使用VLPs(10μg/次)进行免疫,联合中药组在第1至第13天连续灌服中药。中药佐剂按生药量200 mg/kg剂量接种。在免疫第0天、13天及28天采集外周血并分离血浆和单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组外周血浆IL-17A浓度,利用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,Elispot)检测PBMC中分泌IL-17A的细胞数,即斑点形成集落数(spot forming cells,SFCs)。结果(1)无论是在免疫应答早期还是后期,VLPs能有效诱导外周血浆中IL-17A的分泌,而联合益气方组血浆中IL-17A水平进一步提高(P<0.05)；(2) Elispot技术能有效检测PBMCs中分泌IL-17A的阳性细胞。与单纯VLPs免疫组相比,益气方和滋阴方均能显著增加分泌IL-17A的细胞数(P<0.01),在免疫后28天尤为明显。结论益气方、滋阴方可以显著增强流感VLPs诱导的IL-17A表达水平,益气联合滋阴方有望成为新型流感疫苗佐剂。
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中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达发热伴血小板减少综合征病毒样颗粒新方法的研究
为了探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)样颗粒的高效表达方法,本研究根据布尼亚病毒装配成熟的机制,建立SFTS病毒包膜糖蛋白和核蛋白融合表达质粒,并在表达载体中引入荧光蛋白报告基因,转染中国仓鼠卵巢细胞,传代培养两代后,根据荧光蛋白表达水平,采用有限稀释法,在荧光显微镜下,人工挑选细胞集落,建立病毒样颗粒稳定表达细胞系,并通过荧光蛋白表达水平的变化,评价细胞系的稳定性,采用间接免疫荧光、免疫印迹和电子显微镜对病毒样颗粒进行分析鉴定.结果显示,融合表达的包膜糖蛋白和核蛋白可在细胞内装配形成病毒样颗粒并分泌到胞外,在无选择压力条件下筛选的细胞系能够在较长时间内保持稳定,传代40次后报告基因表达水平无明显变化.本研究显示了通过病毒结构蛋白基因的修饰,可以改进病毒样颗粒制备方法,为相关生物制品的生产技术研究提供了重要线索.
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杆状病毒-昆虫细胞系统表达的戊型肝炎病毒衣壳蛋白p495的纯化、结构解析以及免疫原性分析
本研究目的是利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统建立戊型肝炎病毒(HEV) p495蛋白的高效稳定表达和可放大纯化的方法,研究其理化性质和解析三维结构,与上市戊肝疫苗益可宁(Hecolin)进行免疫原性的比较.本研究选择基因1型HEV毒株的开放读码框2(ORF2)的aa112-606片段构建杆状病毒,感染昆虫细胞进行重组蛋白的表达,经过PEG沉淀和阴离子交换层析的纯化,获得纯度为95％以上的p495蛋白,每升细胞培养液终获得15mg的目的蛋白.经ELISA、分析超离、分子排阻色谱和电镜负染等分析显示p495蛋白具有良好的抗原性且呈现为均一的病毒样颗粒(VLP),沉降系数为51.3S,颗粒直径约20nm.冷冻电镜三维结构解析获得分辨率为3.8A的三维结构,揭示p495形成了T=1的等二十面体结构,与已报道的晶体结构相一致.小鼠免疫实验表明p495蛋白与益可宁中p239抗原的免疫原性相当.本研究为进一步开展HEV的受体鉴定、表位结构研究以及疫苗改进等奠定良好的基础.
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基于H5N1禽流感病毒HA2蛋白的通用型流感疫苗初步研究
为研究有效的通用流感疫苗,解决流感疫苗株定期更换的难题.本课题利用乙肝病毒核心抗原(Hepatitis Bcore atigen,HBcAg)蛋白可以形成病毒样颗粒(Virus like larticle,VLP)的特点,将高致病性人禽流感A/Hubei/1/2010(H5N1) HA2的76～130氨基酸(Amino acid,AA)线性保守区(Linear conserved rgion,LCR)与HBcAg融合表达,并对其进行免疫学评价.其结果显示,优化后的LCR-HBc片段能够在pET30a大肠杆菌原核表达系统中大量表达.将纯化后的融合蛋白免疫小鼠,发现LCR-HBc疫苗组H5N1血凝素(Hemoglutination,HA)特异性IgG抗体滴度可达到1∶12 800以上.对免疫后小鼠的A/PR/8/34 (PR8)致死剂量攻毒实验结果显示,LCR-HBc疫苗组肺病毒载量显著低于对照组(P＜0.01),对小鼠的保护率为50％.本研究的开展为流感通用型疫苗的研制提供科学线索.
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人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究
利用PCR技术从HPV16阳性阴道分泌物标本中获得HPV16 L1基因片段,并将其插入表达载体pTO-T7中,构建重组表达质粒pTO-T7-HPV16-L1;以该重组质粒转化大肠杆菌ER2566并表达HPV16 L1蛋白;所表达的HPV16 L1蛋白经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等纯化步骤后,HPV16 L1纯度达到98%以上,并可在体外装配为直径50nm的病毒样颗粒;动物免疫原性研究结果显示,该病毒样颗粒可诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体.上述研究结果表明通过大肠杆菌表达系统制备的HPV16病毒样颗粒具有纯度高,与天然病毒颗粒形态高度相似的特点,并具有高度免疫原性,可以应用于HPV16病毒样颗粒的结构功能研究及HPV16疫苗研发等领域.
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乙型脑炎病毒样颗粒疫苗的制备及其免疫保护效率的初步评价
将乙型脑炎病毒prME及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacmid中,构建重组穿梭载体AcBac-prME.Lipofectine介导其转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-prME.Western-blotting、间接免疫荧光试验及电镜观察,证实Ac-prME介导prME在Sf9细胞中高效表达,且形成了病毒样颗粒.小鼠免疫和攻毒试验表明,该病毒样颗粒免疫可以使小鼠获得有效抵抗乙型脑炎病毒强毒株攻击的能力,保护率高达100％,从而为研制基于乙型脑炎病毒样颗粒的亚单位疫苗奠定了基础.
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含组氨酸标签的甲/乙型流感嵌合体假病毒颗粒的构建和表达
为了获得内含甲/乙型流感病毒部分序列的病毒样颗粒,本研究通过定点突变技术将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的p发夹环结构中,建立通用表达载体D-pET32a-CP-his.并采用聚合酶链反应扩增甲/乙流病毒cD-NA的部分保守区域,将两种病毒的嵌合体基因序列连接到表达载体,转化BL21细胞.经诱导表达和镍柱亲和层析纯化,获得了含有甲/乙型流感病毒部分序列的高浓度和纯度的病毒样颗粒.该病毒样颗粒在4℃和-20℃条件下可稳定保存.本研究构建带有组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体,可以作为以后构建和制备耐RNase的mRNA标准品和质控品的平台;构建的甲/乙型流感嵌合体假病毒可为实验室流感病毒的检测提供新的标准品及质控品.
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腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配
为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究.首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1.将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1.用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达.通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs.结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs.
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基于病毒样颗粒的检测基孔肯雅病毒IgM抗体的MacELISA方法的建立与评价
为了建立捕获法ELISA检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法,本研究分离基孔肯雅病毒结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1基因元件,通过昆虫细胞杆状病毒表达体系,制备病毒样颗粒,免疫昆明鼠制备多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记,建立一种以羊抗人IgM抗体、VLPs抗原和酶标多克隆抗体为基础的MacELISA检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法,通过商业化质控血清,实验室确诊基孔肯雅热、肾综合症出血热患者和健康人群血清标本对所建立方法进行优化和初步评价,并与德国欧蒙公司商业化CHIKV IgM抗体检测试剂盒IIFA-IgM进行比较研究.所建立方法特异性为99％(99/100),重复性检测板内变异性系数低于10％,板间变异系数低于15％,检测限明显低于IIFA-IgM商业化试剂盒(P＜0.0001).结果显示,本方法属常规ELISA方法,操作简单,具有较高的敏感性、特异性,可用于基孔肯雅病毒IgM抗体实验室检测,为该病的诊断和流行病学调查提供新的手段.
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禽流感病毒样颗粒研究进展
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是指由病毒一个或几个结构蛋白自行组装成不含病毒基因组且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒.VLPs因能够模拟天然病毒的构象表位而保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性,可诱导机体产生广泛强大的抗病毒免疫反应,阻止病毒侵入机体,在抗病毒性疾病的预防或治疗性疫苗及诊断试剂的研究开发方面具有巨大的应用前景.本文就禽流感病毒样颗粒相关研究进展进行综述,以期为我国禽流感VLPs的研究提供参考.
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重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体
为研究重组病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP和HPV-6 L1+L2 VLP免疫BALB/c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用.VLP诱导了高滴度(＞1∶10 000)的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮组织的感染.重组HPV-6 VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用.提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗.
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同时表达蓝舌病毒四个主要结构蛋白可装配成病毒样颗粒
为研制蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)基因工程疫苗和进一步研究BTV结构与功能的关系,对BTV病毒样颗粒(VLP)的装配进行了研究.同时在昆虫细胞中表达BTV主要结构蛋白VP7、VP3、VP2与VP5,将细胞裂解液超速离心纯化后,发现主要存在两种形态的颗粒:一种与前文报道的病毒核心样颗粒(CLP)相同,直径约为60nm～70nm,蛋白壳厚10nm～15nm;另一种大小为70nm～80nm,蛋白壳厚20nm～30nm,与完整空心BTV颗粒形态一致.这些颗粒是由VP2/3、VP5与VP7组成的,不含核酸和其它任何BTV蛋白,并且具有诱导中和抗体的活性和血凝活性,与预期结果一致.以BTV13 VP7与VP3蛋白为内壳,以与其基因相比变异较大的BTV10 VP2、VP5为外壳,成功地实现了VLP装配,提示BTV颗粒内壳与外壳蛋白间相互作用引发装配的区域可能是保守的,VP2蛋白的高变性对其与内壳间的相互作用并无影响.
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禽流感病毒样颗粒疫苗研究进展
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的一个或几个结构蛋白组装形成的在形态上类似于病毒的颗粒,无核酸和感染性.近年来,国内外在禽流感VLPs研究领域取得了一些新进展.目前,已有H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1、H7N9和H9N2等多种亚型禽流感VLPs包装成功的研究报道.禽流感VLPs作为疫苗安全性好,可刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫,并且不同亚型间可提供交叉免疫保护,因此在禽流感新型疫苗创制方面具有独特优势和广阔的应用前景.本文就禽流感VLPs的研究进展作一综述,旨在为新型禽流感疫苗研发和防控等工作提供参考和借鉴.
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HPV31 L1 C端截短基因可在昆虫细胞表达体系中高水平制备L1 VLP疫苗
目的 利用昆虫细胞表达体系制备人乳头瘤病毒(HPV)31 L1病毒样颗粒(VLP)疫苗.方法 化学合成法获得昆虫Sf9细胞偏性密码子优化的、C端删除27个氨基酸编码序列的HPV31 L1截短基因( HPV31 L1MΔC),构建重组杆状病毒,感染Sf9细胞进行表达;分别采用超声破碎、含离子型表面活性剂(1% SDS等)或含非离子型表面活性剂(0. 5% TritonX-100)的裂解缓冲液,制备细胞裂解上清;氯化铯超速离心法纯化后经动态光散射及透射电子显微镜鉴定;0. 1 μg的HPV31 L1MΔC VLP于第0和2周肌肉免疫BALB/c小鼠,第4周采集血清分析中和活性.结果 3种裂解方法制备的上清均显示HPV31 L1MΔC蛋白的特异表达,其表达量约占裂解上清总蛋白的10%;采用非离子型表面活性剂获得的裂解上清纯化后,目的蛋白纯度高,产量达11. 5 mg/L;纯化蛋白的水化分子直径为103. 3 nm,均一性好;电镜分析为直径50~60 nm的VLP.免疫血清中HPV31中和抗体滴度为1 440.结论 HPV31 L1MΔC在昆虫细胞表达体系制备的VLP产量高、免疫原性好,可用于生产含HPV31 L1 VLP的多价疫苗.
关键词： 人乳头瘤病毒31型L1 病毒样颗粒 中和抗体 昆虫细胞 -
HPV 18 L1病毒样颗粒的表达纯化及其豚鼠抗血清制备
目的 优化人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期基因L1并在昆虫细胞中表达,获得HPV 18 L1病毒样颗粒(VLP),制备豚鼠抗血清.方法 联合利用昆虫细胞偏性密码子、C末端截短32个氨基酸、降低mRNA二级结构等策略优化HPV 18 L1基因,合成后克隆入pFastBacl载体,构建重组病毒,感染sf9昆虫细胞72 h后进行Western blot表达鉴定,密度梯度离心法纯化后进行纯度鉴定及形态学鉴定,获得HPV 18 L1 VLP,联合弗氏佐剂免疫豚鼠制备抗血清.结果 HPV 18 L1优化基因在昆虫细胞中可有效表达,纯化的HPV 18 L1蛋白纯度达90%以上,电镜观察可见直径约为50 nln的VLP,豚鼠免疫血清中HPV 18 L1 VLP特异性抗体滴度达5.12×105.结论 HPV 18 L1优化基因可在昆虫细胞中高效表达并组装成VLP,制备的高滴度抗血清为HPV 18 L1 VLP疫苗的进一步研究打下基础.
