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双杂交技术在HIV-1研究中的应用进展
随着蛋白组学和基因组学研究的进一步深化,双杂交技术也迅猛发展,在研究细胞内蛋白质分子之间或病毒-宿主之间的相互作用等方面发挥重要作用.本文简述双杂交技术的基本原理、主要类型及其在逆转录病毒HIV-1研究中的应用进展.
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酵母双杂交技术筛选与RIG-Ⅰ相互作用蛋白
目的:筛选人脾细胞cDNA 文库中与维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)所编码蛋白具有相互作用的蛋白基因.方法:通过聚合酶链反应(PCR),以HEK293T细胞RNA为模板扩增RIG-Ⅰ基因的2CARD结构域部分,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒pGBKT7-RIG-Ⅰ2CARD,转化到酵母细胞AH109感受态中,得到阳性克隆AH109[RIG-Ⅰ2CARD].然后将人脾细胞cDNA文库转化进AH109[RIG-Ⅰ2CARD],在含有X-α-半乳糖(X-α-Ga1)四缺营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化DH5α大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选,挑取单克隆菌落抽提质粒,并进行测序,再进行生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵蛋白表达质粒pGBKT7-RIG-Ⅰ2CARD,并能在酵母中表达.筛选出阳性菌落59个,经生物信息学分析,后从脾细胞cDNA文库中筛选出12个与RIG-Ⅰ2CARD 有相互作用的蛋白基因.结论:成功克隆出RIG-Ⅰ2CARD基因,并从脾细胞cDNA文库中筛选出12种能与RIG-Ⅰ2CARD具有相互作用的蛋白基因.
关键词： 维甲酸诱导Ⅰ型基因 酵母菌 人类脾脏cDNA文库 双杂交技术 蛋白质相互作用 -
酵母双杂交系统中LRP16诱饵质粒的构建
目的:在酵母细胞中构建LRP16诱饵质粒,以期从人cDNA文库中钓取可与LRP16相互作用的蛋白.方法:pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收,获得LRP16的基因片段,将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切验证其正确插入方向后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187,并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性.随后提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况.以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性.结果:重组诱饵质粒经酶切验证,片段大小和插入方向均正确,将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性,Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRPl6蛋白.结论:构建的重组质粒pGBKT7-LRP16能够在酵母细胞中正确表达,可作为酵母双杂交系统的诱饵质粒.
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应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白
目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白.方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落.提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆.结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础.
