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LRP16基因对慢性髓系白血病K562细胞促增殖作用的研究
本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响.采用RT-PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框(open reading frame,ORF)片段.将其连接到pGEM-T质粒以构建LRP16基因ORF-pGEM-T重组载体.再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3.1+质粒以构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系.用MTT法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期.结果表明:成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒;建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系;超表达LRP16基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的.结论:超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖.
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Lrp16基因在白血病细胞系及白血病患者骨髓中的表达及其临床意义
本研究分析lrp16基因在白血病细胞系及白血病患者骨髓中的表达,探讨lrp16基因与白血病发生、发展的关系.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测lrp16基因mRNA在4种白血病细胞系及115例白血病患者骨髓中的表达水平,并结合患者临床特征分析lrp16基因在白血病发生、发展中的作用.4种白血病细胞系包括慢性髓系白血病细胞系K562、急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60、急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT4及具有单核细胞特征的白血病细胞系U937.结果表明:lrp16基因在K562、HL-60、MOLT4及U937 4种细胞系中均表达.lrp16基因在急性髓系白血病患者表达阳性率为38%(16/42),其中完全缓解者表达阳性率为13%(4/30),朱缓解者为100%(12/12);在急性淋巴细胞白血病患者表达阳性率为38%(10/26),其中完全缓解者阳性率为16%(3/18),未缓解者为87%(7/8);在慢性髓系白血病患者表达阳性率为36%(9/25),其中完全缓解者阳性率为20%(4/20),未缓解者为100%(5/5);在慢性淋巴细胞白血病患者表达阳性率为31%(7/22),其中完全缓解者阳性率为11%(2/17),未缓解者为100%(5/5).lrp16基因表达在各种白血病亚型之间无差异,但各亚型中完全缓解者与未缓解者之间存在显著差异(p<0.001).结论:lrp16基因是一个白血病癌基因,与白血病的发生、发展密切相关,有可能作为临床白血病治疗疗效的评价指标.
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抑制lrp16基因表达药物的生物信息学筛查
本研究通过分析lrp16基因启动子的DNA序列,在负性调控功能区内寻找顺式元件,为筛选有抑制lrp16基因表达的药物奠定基础.以人类基因组数据库和计算机互联网为平台,钓取lrp16基因5'侧翼区3 000 bp非编码DNA序列和mRNA序列中的ORF序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件在人类转录因子数据库中搜索可能存在的顺式结构;利用SAGE和GEO数据库对影响Irp16基因表达的相关药物作用进行分析.结果发现,lrp16基因在长度为3 000 bp的启动子区内,在负向表达调控区域存在多个顺式结构,其中包括T-Ag、Pu.1、c-Ets、XPF-1、AP2 αA、IL6-6RE和RAR.培养的体外细胞系在激素类物质皮质酮、他莫昔芬、毛喉素或去氧肾上腺素、炎性细胞因子IL4或TNFα或化疗药物5-氟尿嘧啶的作用下,lrp16基因的表达水平明显下降.结论:T-Ag、PU.1、c-Ets、XPF-1、AP2 αA、IL6-6RE和RAR等转录因子可能抑制lrp16基因的表达;激素类物质皮质酮、他莫昔芬、毛喉素或去氧肾上腺素,炎性细胞因子IL6、IL4或TNFα,或化疗药物5-氟尿嘧啶可能具有抑制lrp16基因表达的作用.
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LRP16基因启动子活性分析
本研究的目的在于分析LRP16基因不同启动子区域的活性,为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础.在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5侧翼区2.7kb的基因组序列,设计PCR引物,从健康外周血单个核细胞中克隆和亚克隆了LRP16基因的启动子分子,对各个长度相差400 bp左右的亚克隆启动子片段调控荧光素酶表达的作用强度进行比较分析.结果获得了与GeneBank序列一致、长度为2.6kb的LRP16基因启动子DNA序列,其主要调控序列在LRP16基因转录起始位点5侧翼区的-200至-600bp.结论:LRP16基因启动子是一个典型的Ⅱ型启动子,其启动子活性在-200至-600 bp区域强.
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LRP16融合蛋白载体的构建及其原核表达
目的观察和鉴定LRP16在大肠杆菌中的表达,并分离、纯化其蛋白产物.方法应用DNA重组技术,用RT-PCR 方法从正常人血液中扩增出LRP16基因全长及其抗原表位区,构建重组表达质粒pRSET-C-LRP16,IPTG诱导表达并纯化融合蛋白采用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定.结果成功构建LRP16基因融合蛋白载体,SDS-PAGE显示pRSET-C-LRP16表达于原核细胞,蛋白经电泳分离,切胶后获得纯化的LRP16蛋白.结论制备的高纯度的LRP16蛋白,可在大肠杆菌中稳定表达.
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LRP16通过增强ERα介导的转录激活活性促进乳腺癌MCF-7细胞增殖
目的:探讨LRP16基因促进MCF-7细胞增殖的分子生物学机制.方法:(1)将ERα模式启动子调控的荧光素酶报告子(3×ERE-Luc)与ERα,LRP16真核表达载体共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc的相对荧光素酶活性;(2)将3×ERE-Luc,ERα真核表达载体、针对LRP16的小干扰RNA(LRP16-siRNA374,LRP16-siRNA668)或对照小干扰RNA(control-siRNA)共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc的相对荧光素酶活性;(3)用Northern 印迹与Western 印迹方法检测抑制LRP16基因后MCF-7细胞中ERα下游靶基因对雌激素刺激的反应性.结果:(1)LRP16增强3×ERE-Luc的相对荧光素酶活性,并呈现剂量依赖性,该效应依赖于雌激素对ERα的激活;(2)Northern 印迹结果显示,抑制LRP16表达限制了雌激素对ERα下游靶基因表达水平的刺激上调,包括E2F1、视黄酸受体(RARα)、c-fos和MTA3,但没有影响组织蛋白酶D(cathepsin D)的反应性;Western 印迹结果显示,抑制LRP16限制了雌激素对细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的刺激.结论: (1)雌激素反应性靶基因LRP16反馈增强ERα介导的转录激活活性;(2)LRP16基因通过增强ERα介导的转录激活活性调节其下游靶基因的表达,主要通过改变cyclin D1的水平促进MCF-7细胞的增殖.
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LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建
目的:克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.方法:①以LRP16基因全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3 kb基因组DNA序列.②以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段,将分离纯化的PCR产物用T4 DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连,转入JM109感受态化大肠杆菌,筛选阳性克隆并测序,进行Kpn Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切和巢式PCR鉴定.③将LRP16启动子-pGEM-T Easy载体再次酶切,纯化回收鉴定过的目的DNA片段,构建LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.结果与结论:长度为2.7 kb的LRP16基因启动子克隆成功,并构建了LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源,搜索已知基因的启动子序列,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的.
关键词： LRP16基因 启动子 pGL3-Basic载体 聚合酶链反应 -
长型LRP16基因真核表达载体的构建及在HL60细胞中的表达
目的:构建长型LRP16基因开放阅读框架序列的真核表达载体,并观察其在髓系白血病细胞系HL60细胞中的表达情况.方法:采用RT-PCR方法自1例健康献血员外周血单个核细胞中克隆长型LRP16 cDNA;将长型LRP16 cDNA克隆入 pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定;将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LLRP16;脂质体介导法将其转染HL60细胞,培养72 h后用RT-PCR方法检测转染细胞中长型LRP16基因的表达情况.结果与结论:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人长型LRP16基因序列;转染实验表明 LRP16基因能在HL60细胞中过表达,为进一步研究长型LRP16基因功能奠定了基础.
关键词： LRP16基因 pcDNA3.1(+) HL60细胞 基因表达 -
Sp1介导雌激素上调LRP16基因表达的研究
目的:研究Sp1在雌激素上调LRP16基因表达中的作用.方法:采用ERα,Sp1特异性单抗对雌激素作用不同时间点的MCF-7细胞进行染色质免疫共沉淀,snPCR扩增沉淀DNA上LRP16基因启动子区;化学合成Sp1小干扰RNA,与pS10荧光素酶报告重组子共转染MCF-7细胞,双荧光素酶测定法检测Sp1-SiRNA对LRP16基因表达的抑制作用.结果与结论:染色质免疫共沉淀结果提示Sp1蛋白直接结合于LRp基因-213 bp至-24 bp区域,雌激素激活的ERα增强其与DNA的结合力上调LRP16基因表达;应用Sp1小干扰RNA有效抑制了LRP16基因的雌激素反应性,明确了Sp1所结合的DNA顺式元件,从反面证实了Sp1蛋白对LRP16基因启动子区域递呈E2转激活活性的增强效应.
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LRP16基因抗紫外线DNA损伤作用的研究
目的根据基因编码序列推测其氨基酸序列,预测LRP16基因编码蛋白的功能并通过实验加以证实.方法利用GeneBank数据库获取LRP16基因序列,然后推测出该基因编码蛋白质的一级结构,对该序列蛋白结构域的同源性进行搜索;将LRP16基因ORF插入pcDNA3.1,构建LRP16基因的真核表达质粒,采用Superfect稳定转染急性粒细胞白血病细胞系HL-60,筛选稳定表达LRP16基因的细胞;以紫外灯照射筛选后有HL-60稳定过表达的HL-60细胞和对照细胞;采用单细胞凝胶电泳技术检测有LRP16过表达对HL-60细胞增殖及DNA损伤后修复的影响.结果在LRP16基因理论蛋白序列的第148至315氨基酸残基之间具有与人类组蛋白H2A1C末端相类似的同源序列hismacro、COG2110和A1pp,同源性高达80%以上.LRP16基因的过表达具有抗紫外线引起HL-60细胞DNA损伤和增强损伤后的修复作用.结论LRP16基因编码蛋白可能具有抗紫外线的DNA损伤作用.
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LRP16基因的多克隆抗体制备及表达的探索
目的:制备人LRP16蛋白多克隆抗体并利用该抗体检测LRP16蛋白表达及亚细胞定位.方法:利用已构建的pRSET-C载体和LRP16基因组成的连接产物转化BL-21缺陷型大肠杆菌.诱导该基因原核表达,快速蛋白免疫法获取相应的多克隆抗体,利用免疫组化法观察LRP16基因产物在人多种组织中的表达差异.结果:成功获得高效的LRP16抗体,利用该抗体初步证实LRP16基因编码产物的在不同雌激素受体水平的组织分布特点.结论:制备的LRP16抗体及其全长基因可用于LRP16基因的生理功能及病理学研究,初步发现LRP16基因的表达与雌激素受体呈正相关.
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LRP16基因的SAGE谱及其在正常血细胞、白血病细胞中的表达状况
目的:通过信息学和实验学的方法检测LRP16基因在肿瘤细胞以及在造血发育不同阶段的表达状况,探讨其在肿瘤发生、发展以及在血细胞成熟过程中可能的作用.方法:以NCBI提供的高通量CGAP/SAGEmap数据库为实验对象,"Virtual Northern"程序为实验工具,分析比较了LRP16基因在多种肿瘤组织、细胞系和相应正常组织中的表达谱;采用半定量RT-PCR方法检测了该基因在多种正常血细胞及白血病细胞中的表达量.结果:SAGE结果显示LRP16在人类多种肿瘤细胞中的表达量明显高于其正常对应组织.脐血中未检测到LRP16表达,正常骨髓及经G-CSF动员的PBSC(peripheral blood stem cells)中的表达量明显低于正常人外周血、原代白血病细胞及白血病细胞系(P<0.001).结论:LRP16在不同的血细胞中表达量不同.同时表明LRP16与急性白血病等多种肿瘤的发生、发展存在相关性;在初诊与复发白血病中,LRP16的表达差异值得进一步研究.
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新的白血病相关基因LRP16的克隆
目的:发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制.方法:应用分子克隆技术RLGS及RACE技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因.结果:克隆到一个长度为2948 bp 的DNA片段,经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分,并定位于第11号染色体长臂11区,进一步克隆到这一基因的全长cDNA,其长度为980 bp,并被国际基因库以新的人类基因LRP16收录入库.结论:RLGS及RACE技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法,LRP16基因的发现对于探讨白血病发生机制具有一定意义.
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酵母双杂交系统中LRP16诱饵质粒的构建
目的:在酵母细胞中构建LRP16诱饵质粒,以期从人cDNA文库中钓取可与LRP16相互作用的蛋白.方法:pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收,获得LRP16的基因片段,将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切验证其正确插入方向后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187,并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性.随后提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况.以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性.结果:重组诱饵质粒经酶切验证,片段大小和插入方向均正确,将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性,Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRPl6蛋白.结论:构建的重组质粒pGBKT7-LRP16能够在酵母细胞中正确表达,可作为酵母双杂交系统的诱饵质粒.
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LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定
目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠，为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞，鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白，随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中，获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定，并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达，经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠，阳性率为6.23%，选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠，通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠，其中4只为阳性鼠，阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠，PCR鉴定结果显示2只为阳性，阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中，并且能够稳定遗传，为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。
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抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性
目的 探明LRP16的表达与化疗药物足叶乙甙所诱导的肿瘤细胞凋亡是否产生作用以及可能的分子机制.方法 首先将抑制LRP16表达的小干扰RNA,control,siRNA,siRNA-374(抑制率90％),siRNA-668(抑制率60％),对照分别转染入Hela细胞内,并通过足叶乙甙处理的细胞而导致DNA损伤.之后用CCK-8检测细胞活力；用流式细胞技术测定抑制LRP16的表达对Hela细胞凋亡率的影响；通过RT-PCR检测抑制LRP16表达之后核转录因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)凋亡相关的下游靶基因的mRNA水平.结果 在足叶乙甙(100μmol)的作用下,抑制LRP16的表达能够明显抑制细胞的增长(P＜0.05),并呈浓度依赖性,同时增加细胞的凋亡率(P＜0.05).RT-PCR结果显示,下调LRP16的表达减弱NF-κB的转录活性,进而对其下游靶基因的水平进行调节.结论 LRP16在足叶乙甙导致的凋亡起重要作用,而且可能是通过下调NF-κ B的活性来发挥化疗药物抵抗效应.我们的实验结果初步证实抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性.
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用克隆技术分析新白血病相关基因LRP16对白血病发病机制的影响
目的：探讨应用克隆技术分析新白血病相关基因LRP16对白血病发病机制的影响。方法：使用相关分子克隆技术RLGS及RACE，对急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆出的新白血病相关基因进行研究，并探讨新白血病相关基因对白血病发病机制的影响。结果：我们在急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆出一条长度为2450bp的DNA片段。经过国际基因验证为未知基因的一部分。我们将这个DNA片段定位于第10号染色体长臂10区，并克隆到该基因的全长。该基因的全长为860bp。我们将发现的新基因以新的人类基因LRP16收录至国际基因库中。结论：使用相关分子相关克隆技术可以有效地发现新的白血病相关基因，而且新的白血病相关基因对研究白血病的发病机制具有重要作用。此方法值得在临床上推广使用。
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真核表达质粒EX-Y2069-M29的构建及LRP16基因在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达
目的 构建LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29,检测LRP16基因在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达.方法 体外培养人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,提取总RNA,应用PCR技术,扩增获得LRP16基因编码序列片段,克隆入真核表达载体EX-Y2069-M29,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将LRP16真核表达载体EX-Y2069-M29和EX-NEG-M29空质粒转染细胞,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法分析LRP16基因的表达情况.结果 经LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29转染的HEC-1-B细胞中检测到LRP16基因的表达.结论 构建的LRP16基因重组真核表达质粒EX-Y2069-M29转染HEC-1-B细胞后,可在HEC-1-B细胞中稳定表达,为进一步研究LRP16基因奠定了基础.
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基于生物信息学分析人类LRP16基因功能初步研究
背景与目的:LRP16基因是新发现的白血病相关基因,其生物学功能还远未被阐明.本研究基于生物信息学分析探讨人类LRP16基因的生物学功能.方法:采用生物信息学方法分析LRP16基因启动子及编码蛋白的结构、功能,并对预测结果进行实验验证.建立pGL3-Basic重组载体,并进行荧光素酶活性分析.构建ORF-pcDNA3.1+真核表达载体,转染入HL-60、K562细胞后,采用单细胞凝胶电泳法检测HL-60细胞紫外线损伤,流式细胞术检测K562细胞周期.结果:LRP16基因启动子是一个典型的Ⅱ型真核肩动子,核心调控区位于-600 bp以内,具有7个与细胞周期、造血调控、细胞增殖及DNA损伤修复等有关的顺式作用元件.LRP16基因长型编码蛋白在148-315氨基酸残基之间具有与人类组蛋白H2AlC末端相类似的同源序列hismacro、COG2110和A1pp.紫外线照射HL-60细胞后,LRP16过表达组的彗星细胞数量、慧尾长度明显小于空质粒对照组,且活细胞数量明显多于空质粒对照组.过表达LRP16基因的K562细胞的增殖速度和G_2/M期、S期细胞均明显高于空质粒对照组,且提前达到平台期.结论:基于生物信息学方法分析表明LRP16基因具有促进白血病细胞增殖、调控细胞周期及抗紫外线的DNA损伤作用.
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LRP16基因在子宫内膜癌组织中的表达及其对细胞增殖的作用
目的：研究LRP16在子宫内膜癌组织中的表达变化及其对子宫内膜癌 HEC-1-B细胞增殖的影响。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测26例正常子宫内膜组织及10例子宫内膜癌组织中LRP16 mRNA的表达；LRP16转染细胞， RT-PCR证实转染的成功性，WST-1法观察细胞增殖的变化。结果子宫内膜癌组织中LRP16 mRNA的阳性表达率及表达水平（分别为83．33％、0．82±0．21）明显高于正常子宫内膜组织（分别为30．00％、0．47±0．18），二者比较差异有统计学意义（ P＜0．05）。RT-PCR检测结果显示转染后细胞LRP16 mRNA表达明显增加。转染组 HEC-1-B细胞在体外能继续增殖，但增殖能力并没有增强。结论： LRP16的异常表达可能与子宫内膜癌的发生、发展密切相关，LRP16基因用于子宫内膜癌基因治疗可能具有潜在价值。
