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双色双融合荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病Bcr/Abl基因重排的研究
本研究探讨双色双融合荧光原位杂交技术(DC-DF-FISH)在慢性髓系白血病(CML)中的应用价值,应用常规R-显带技术、DC-DF-FISH、RT-PCR技术检测41例CML患者的染色体核型及bcr/abl融合基因.结果表明,对于初诊CML的18例患者,R-显带显示Ph染色体阳性检出率为94.4%(17/18),DC-DF-FISH阳性检出率也为94.4%(17/18),对于治疗后CML的18例患者,R-显带显示14例有可分析分裂相,其中有11例存在Ph染色体,阳性检出率为78.6%(11/14);而用DC-DF-FISH检测治疗后患者的阳性率为94.4%(17/18);移植后的5例患者R-显带均未检出Ph染色体,而FISH检测出1例bcr/abl基因阳性,RT-PCR证实了FISH的检测结论,但在移植患者中,RT-PCR无阳性发现.结论:双色双融合荧光原位杂交技术具有高度的准确性、可靠性,是检测CML患者bcr/abl基因重排的可靠方法,适用于CML的诊断、疗效判定及微小残留病灶的检测.
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β-catenin在慢性粒细胞白血病中的表达及与bcr/abl的关系
本研究检测β-catenin在慢性粒细胞白血病(CML)各期中的表达情况,并与bcr/abl的表达变化相比较,为进一步探讨β-catenin在CML急性变中的意义提供依据.首先分离CML各期患者及正常供者骨髓单个核细胞(BMMNC),提取总RNA,逆转录为cDNA,用实时定量PCR的方法检测β-catenin的表达情况,同时检测部分标本bcr/abl的表达情况,分析二者在CML进展过程中的表达变化及两者的相关性.结果表明:β-catenin在CML急性变期BMMNC的表达明显高于慢性粒细胞白血病(CML)慢性期(p＜0.001)、加速期(p=0.016)及正常人(p=0.004),而在后三者之间未见统计学差异.急性变期bcr/abl的表达明显高于慢性期(p=0.001).β-catenin的表达量与bcr/abl表达水平有明显的相关性(r=0.620,p＜0.001).结论:CML急性变期β-catenin的表达明显升高,并与bcr/abl的表达量有相关性.β-catenin的表达增高可能与CML急性变有关.
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汉防己甲素联合屈洛昔芬对K562细胞bcr/abl表达的影响
为了研究汉防己甲素(Tet)联合屈洛昔芬(DRL)对K562细胞株凋亡相关因子bcr/abl mRNA及蛋白表达的影响,Tet(1μmol/L)和DRL(5μmol/L)单用及联合应用于K562细胞一定时间后,分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测K562细胞bcr/abl mRNA和蛋白表达的变化.结果表明:Tet和DRL单独应用对K562细胞bcr/abl mRNA及蛋白表达均无影响,两药联合应用于48小时K562细胞bcr/abl mRNA表达开始下调,K562细胞P210BCR/ABL蛋白表达于72小时开始下调.结论:Tet和DRL联合应用可下调K562细胞bcr/abl的表达,这可能是两药联用逆转耐药的机制之一.
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小檗胺对K562细胞体外及体内作用的实验研究
为了探讨小檗胺(berbamine,BER)在体外及体内抗人白血病细胞株K562细胞的作用及其可能的机制,用MTr法测定K562细胞的增殖抑制,用流式细胞术检测凋亡细胞,用RT-PCR方法检测bcr/abl基因表达,用Westem blot方法检测BCR/ABL蛋白质水平表达,利用K562细胞荷瘤裸鼠模型观察小檗胺治疗后瘤体大小、组织病理及bcr/abl基因表达的改变.结果表明:小檗胺对K562细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间-浓度依赖关系.经8.0μg/ml BER作用24、48、72小时,对K562细胞的抑制率分别为(26.63±3.57)%,(61.84±4.74)%,(75.32±1.95)%,与对照组相比,P＜0.01.IC50值(72小时)为(5.227±1.307)μg/ml.与空白对照组相比,经8.0μg/ml小檗胺处理72小时后,K562细胞凋亡率明显增加[(61.77±4.35)%vs(0.50±0.14)%,P＜0.01].小檗胺能下调K562细胞bcr/abl mRNA表达和P210水平,且呈浓度-时间依赖效应,并与细胞凋亡率有一定的相关性.经8.0μg/ml BER处理后,与同浓度点对照组相比,72小时组的表达明显地减弱(0.97±0.01vs1.38±0.02,P＜0.01).4.0-16.0μg/ml BER处理24小时后,P210的相对表达量由未加药对照组的1.04±0.02降至16.0μg/ml组的0.63±0.01(P＜0.01),与所设的对照组药物酪氨酸蛋白激酶抑制剂STI571的作用结果相似.在K562荷瘤裸鼠模型,小檗胺治疗组瘤重较未治疗对照组的明显减少[(1.46±0.43)g vs(2.90±0.94)g,P＜0.01],抑瘤率为49.66%.瘤体细胞的bcr/abl mRNA的表达水平明显下调.结论:小檗胺在体外对K562细胞具有明显的增殖抑制作用及明确的诱导凋亡作用,并呈时间-浓度依赖关系;小檗胺诱导细胞凋亡可能与其下调bcr/abl基因和(或)P210的表达水平有关;在荷瘤裸鼠体内,小檗胺同样具有显著的抑制K562细胞生长的作用,尤其能下调瘤体组织细胞bcr/abl mRNA的表达水平.
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慢性粒细胞性白血病中SHIP1基因的表达变化及机制探讨
目的 观察SHIP1基因在慢性粒细胞性白血病(CML)患者中的表达变化,并通过特异性小干扰RNA(siRNA)封闭K562细胞株BCR-ABL基因的表达,探讨BCR-ABL基因表达对SHIP1基因的影响.方法 应用RQ-PCR方法检测CML患者骨髓、正常人外周血白细胞及白血病细胞株K562中SHIP1基因表达的差异.另取K562细胞分为3组:空白对照组(不加任何干扰成分);非特异性siRNA处理组(加非特异性siRNA);特异性siRNA处理组(加入特异性siRNA封闭BCR/ABL融合基因),应用RQ-PCR及Western blot方法分别检测3组中BCR/ABL、SHIP1基因的mRNA及其相应蛋白P210(BCR/ABL编码)、P145(SHIP1基因编码)的表达,并比较各组中表达水平的变化.结果 CML患者骨髓白细胞和K562细胞中SHIP1基因的表达明显低于正常人的外周血白细胞.特异性siRNA处理组中BCR-ABL基因mRNA和P210蛋白的表达水平明显下降,SHIP1基因mRNA和P145蛋白表达水平随BCR-ABL表达下降而增加;非特异性siRNA处理组与空白组相比无明显差异.结论 CML患者SHIP1基因的表达低于正常人;特异性siRNA能够抑制BCR-ABL基因的表达;BCR-ABL基因能抑制SHIP1基因及其蛋白表达.
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慢性髓细胞白血病以血小板显著增多为首发表现1例并文献复习
目的 探讨以血小板增多为首发表现的慢性髓细胞白血病(CML)的临床表现及生物学特点. 方法 对患者外周血细胞形态、骨髓细胞形态、免疫组织化学、染色体、融合基因、流式细胞术、骨髓活检进行检查. 结果 以血小板增多为首发表现CML与典型慢性髓细胞白血病临床表现存在差异,易误诊为原发性血小板增多症(ET). 由于CML可向加速期、急变期演变,应尽早进行有效药物干预.结论 对血小板增多的患者应常规进行Ph染色体及bcr/abl融合基因检测,尽早鉴别ET及CML,避免延误治疗.
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慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响
目的:研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响. 方法:构建含bcr/abl RNAi序列的pNL-B/A-EGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆(B/A-K562).Real-time PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AO-EB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase-3、Caspase-9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFP-K562作对照. 结果:成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/A-K562细胞, Real-time PCR及Western blotting证实B/A-K562细胞中bcr/abl mRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调.bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长(37.1 vs 20.4、23.3 h)、集落形成能力减弱(P<0.01),K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降(P<0.01),自发凋亡率显著提高(P<0.01),细胞中Caspase-3(P<0.05)及Caspase-9(P<0.01)活性明显提高.结论:慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡.
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定量PCR监测干扰素联合阿糖胞苷治疗慢性粒细胞白血病患者bcr/abl基因表达的临床意义
目的:评价bcr/abl融合基因作为观察治疗慢性粒细胞白血病(CML)疗效指标的临床价值.方法:采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术检测28例经干扰素(IFN)联合阿糖胞苷(Ara-C)治疗的CML患者bcr/abl mRNA水平.结果:骨髓Ph染色体数与bcr/abl融合基因水平具有较强的相关性(r=1.74,P＜0.01).IFN联合Ara-C治疗CML 6个月后完全持续缓解8例,部分缓解11例,主要细胞遗传学反应为67.85%.结论:bcr/abl融合基因可能是治疗CML疗效观察和微小残留病灶监测的有效指标.
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慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因表达及临床意义
目的:探讨慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因出现的频率及临床意义.方法:采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,研究了慢性粒细胞白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)bcr/abl基因的变化.结果:48例慢性期CML,43例呈现bcr/abl基因阳性,占89.6%,14例加速,急变期CML,6例出现bcr/abl基因,阳性率为42.9%,与慢性期CML相比P＜0.01;10例PV出现1例bcr/abl基因阳性,占10.0%.结论:bcr/abl基因检测对于CML的临床分型有重要意义,bcr/abl阴性的CML预后差,而bcr/abl基因的阳性有助于初诊时的CML急变与急性非淋巴细胞白血病(AML)M2的鉴别和CML与慢性粒单细胞白血病(CMML)的鉴别.
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EVI1与BCR/ABL基因共表达的儿童白血病临床分析
目的 研究EVI1与BCR/ABL基因共表达的儿童白血病的临床特征.方法 收集并比较分析4例EVI1与BCR/ABL基因共表达的儿童白血病以及8例BCR/ABL基因表达阳性而EVI1表达阴性的慢性粒细胞性白血病(CML)的临床资料.结果 4例EVI1与BCR/ABL基因共表达的白血病患儿初诊时2例为CML慢性期,1例为CML加速期,1例为高危急性淋巴细胞性白血病(ALL).3例EVI1与BCR/ABL基因共表达的CML与8例BCR/ABL基因表达阳性而EVI1表达阴性CML临床特征比较无明显差异.EVI1与BCR/ABL共表达的患儿均高表达CD33、CD38.染色体分析发现4例患儿都存在t(9; 22).截止到随访日期2013年8月,3例EVI1基因表达阳性的CML患儿2例在治疗1个月或3个月后达到血液学缓解;2例BCR/ABL基因和EVI1基因均未转阴,1例EVI1基因转阴而BCR/ABL基因仍未转阴.除ALL第一疗程治疗后未达缓解,放弃治疗失访外,其余3例患儿均存活,无复发,总生存期分别为20、13、14个月.结论 EVI1与BCR/ABL融合基因共表达可存在于儿童CML和ALL中,其临床特征无特异性,其预后还需扩大样本量进一步明确.
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Wortmannin抑制PI3K途径对bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和凋亡抗性影响的研究
目的探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用.方法用磷酰肌醇-3激酶(PI3K)特异抑制剂Wortmannin(WT)抑制PI3K活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V(Annexin-V-Flous)标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数.观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化.结果 K562、NB4和HL60细胞在24、48、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%.生长曲线显示WT抑制PI3K途径可显著抑制K562细胞的增殖,对NB4和HL60细胞增殖无明显影响.K562、NB4和HL60细胞加和不加WT,培养14d后的集落形成率分别为:16.15%和7.60%,5.90%和6.10%,6.60%和6.40%.集落形成抑制率为52.94%、3.39%和3.03%.K562、NB4和HL60细胞加WT、AraC、WT+AraC作用24h后的凋亡细胞百分比分别为(17.27±1.94)%、(23.25±14.12)%、(17.60±1.27)%;(17.00±3.36)%、(20.55±8.57)%、(22.07±5.62)%;(27.60±4.36)%、(17.56±9.28)%、(20.50±7.97)%.凋亡指数分别为(6.88±2.66)、(7.79±2.75)、(3.03±0.56);(8.91±3.86)、(9.35±4.19)、(3.79±0.93);(13.39±4.49)、(7.61±6.35)、(5.27±2.69).结论 WT可以通过抑制PI3K通路抑制K562细胞的增殖,促进K562细胞的凋亡,PI-3K途径是bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和抗凋亡的重要信号传导通路.
关键词： 白血病 bcr/abl基因 信号传导通路 磷酰肌醇-3激酶 Wortmannin -
伊马替尼对免疫功能和造血系统影响的研究进展
伊马替尼通过选择性竞争结合abl酪氨酸蛋白激酶的ATP结合位点而有效地治疗慢性粒细胞白血病(CML).和其他药物相比,伊马替尼能够使CML患者获得更高的细胞遗传学反应和持久的缓解率,且耐受性好,不良反应轻.它已被越来越多地用于治疗Ph+染色体的白血病和其他恶性疾病.但是,近年来研究表明伊马替尼对免疫和造血系统有抑制作用,本文就国外在这方面的研究进展作一简要综述.
