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LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建
目的:克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.方法:①以LRP16基因全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3 kb基因组DNA序列.②以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段,将分离纯化的PCR产物用T4 DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连,转入JM109感受态化大肠杆菌,筛选阳性克隆并测序,进行Kpn Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切和巢式PCR鉴定.③将LRP16启动子-pGEM-T Easy载体再次酶切,纯化回收鉴定过的目的DNA片段,构建LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.结果与结论:长度为2.7 kb的LRP16基因启动子克隆成功,并构建了LRP16基因启动子-pGL3-Basic载体.充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源,搜索已知基因的启动子序列,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的.
关键词： LRP16基因 启动子 pGL3-Basic载体 聚合酶链反应 -
GDF5基因启动子表达载体的构建
目的 构建含人生长分化因子5(GDF5)基因启动子表达载体pGI3-GDF5,为研究GDF5在骨骼、肌肉发育的作用机制提供实验基础.方法 扩增人GDF5基因启动子序列,克隆至pG13-Basic表达载体并转化人大肠杆菌DH106,双酶切鉴定并测序.结果 PCR扩增后的产物在约854bp处出现明显的特异性条带,酶切鉴定结果与理论预测值一致,测序未出现碱基突变.结论 成功构建了含GDF5基因启动子的表达载体.
关键词： 生长分化因子5 pGL3-Basic载体 质粒 -
调控毛囊生长CCDC72基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建
目的 对新发现的调控毛囊生长相关的CCDC72基因启动子序列进行分析,克隆并构建不同长度启动子萤光素酶报告基因载体.方法 运用在线软件Cister对CCDC72基因5'端2000bp进行启动子特征分析;以人毛乳头细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增目并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板PCR得到不同长度的启动子片段,并测序,将获得启动子片段插入pGL3-Basic载体.结果 序列分析发现起始密码子ATG上游的-1～-200bp及-600 ～-1000bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功获得1924bp扩增片段,并构建了4个不同长度的CCDC72启动子报告基因载体.结论 上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究CCDC72基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础.
