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云南省不明原因发热患者恙虫病东方体实验室检测分析
目的 对云南省不明原因发热患者进行恙虫病东方体检测与分析.方法 应用间接免疫荧光方法(IFA)和PCR(nPCR)法对不明原因发热患者分别进行恙虫病东方体(Or) IgG抗体和sta56基因检测及其基因序列测定分析.结果 在79例发热患者中,Ot IgG抗体阳性率48.10％,Ot核酸阳性率3.80％.基因序列分析显示序列12-17与日本03株同源性高为99.8％,序列12-9与中国台湾KM05、TW45R等株的同源性高均为99.8％,序列11-6与中国台湾KM05、TW45R等株的同源性高均为100％.进化树分析显示序列12-17、12-9和11-6均为Karp型Ot.结论 云南省恙虫病患者中存在Karp型Ot感染,其基因进化来源可能复杂.
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广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子流行病学特征
手足口病主要由柯萨奇病毒A组16型(CVA16)与人肠道病毒71型(EV71)感染引起[1],也有少量由CVA6感染引起[2,3].本研究对2011年广州市手足口病标本检出的CVA6病毒开展分子流行病学研究.1.材料与方法:(1)病例来源及诊断标准:病例来自广州市2011年5-10月哨点监测医院及各级疾病预防控制中心,共采集1 560名疑似手足口病患者标本,包括粪便1 450份、肛拭子74份、咽拭子35份、脑脊液l份,标本采集后及时-20℃冻存,冷藏运输至广州市疾病预防控制中心进行检测,标本处理方法见文献[3].诊断标准参见文献[4].同时收集临床资料.
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北京地区麻疹野病毒基因型特征分析
对北京市18个区(县)及铁路等疾病预防控制中心1998-2006年4月采集的210例麻疹疑似病例标本(318份)进行了病毒分离和基因序列分析.
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小鼠CSE基因启动子克隆及其活性测定
目的 研究克隆了小鼠CSE基因启动子,并分析和检测了其调控活性.方法 以小鼠血液基因组DNA为模板,克隆了小鼠CSE基因启动子序列,回收纯化,直接连接pGL4.12载体,测序.利用生物信息学软件,分析了CSE基因启动子序列的正确性,利用瞬时转染的方法测定报告基因的活性,根据荧光强度的相对值的大小测定启动子活性.结果 发现CSE启动子上转录因子结合位点转录因子结合位点92分以上的有25个.其中,GATA有4个,SRY有3个,USF有2个,MZF1有2个,v-Myb有2个,CdxA有2个,TATA有1个,AML-1a有1个,RORalp有1个,C/EBP有1个,Nkx-2有1个,Lyf-1有1个,N-Myc有1个,HSF2有1个,E2F有1个.CSE基因调控区没有发现CpG岛.结论 研究结果为进一步CSE基因转录和表达调控机制的研究奠定了实验和理论基础.
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中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆
人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)感染与宫颈癌的发生有密切关系.研究发现,HPV16早期蛋白E6是肿瘤相关抗原,可在HPV相关肿瘤中持续表达,为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位.但也有文献报道,宫颈癌中HPV16E6基因可有一定的变异性,变异株可逃避机体体液和细胞免疫的攻击,给相应疫苗研制带来困难.为制定合理、有效的疫苗设计策略,本研究选择去除氨基端转化活性的HPV16E6羧基(C)端基因片段(nt254-559)作为构建疫苗的抗原基因,对我国妇女宫颈癌组织中E6C基因片段的序列进行分析,并在此基础上进行E6C的分子克隆,以期为宫颈癌HPV16E6DNA疫苗的研制提供资料.
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手足口病柯萨奇病毒A10和A6型的分子鉴定及其VP1区3′端序列分析
目的 鉴定手足口病患儿咽拭子病原体柯萨奇病毒A10(CVA10)和A6(CVA6),并对其VP1编码区3'端序列进行分析.方法 合成对肠道病毒VP1区3'端序列具有较高特异性的兼并引物040-011,RT-PCR方法测定其VP1区3'端基因序列,通过BLAST程序比对,鉴定病毒的基因型；与GenBank中其他已知病毒基因型序列进行同源性分析,构建遗传进化树.结果 38例非EV71非CVA16引起的手足口病患儿咽拭子,5例检测到CVA10,1例检测到CVA6.在进化关系上CVA10与D基因型为密切,核苷酸和氨基酸同源性分别为92.7％～94.2％、91.7％～100％；CVA6与2003～2009年报告的部分毒株核苷酸同源性为86.8％～90.2％,其中与2008年台湾EU908148的毒株同源性高；氨基酸同源性为85.2％～89.0％.结论 兼并引物040-011对CVA10和CVA6有良好的基因扩增特异性；引起手足口病的肠道病毒除EV71和CVA16外,CVA10和CVA6也是重要的病原；鉴于2008年芬兰和2009年山东省文登市CVA10引起的手足口病暴发,应加强对手足口病病原的检测和分型,以了解柯萨奇病毒在手足口病中的位置,掌握其遗传进化特征.
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甲型H1N1流感病毒基因特征及耐药性研究
目的 研究甲型H1N1流感病毒的基因特征和变化规律,为流感疫苗评价提供依据. 方法 选取2009年6月-2013年4月本院分离出的15株甲型H1N1病毒分离株,提取病毒RNA进行反转录.采用PCR方法扩增15株甲型H1N1流感病毒HA和NA全基因并进行测序分析.利用软件Bioedit和MEGA软件对序列进行拼接,绘制种系发生树,采用邻位相临法构建进化树. 结果 15株甲型H1N1流感病毒均为低致病性病毒,对神经氨酸酶抑制剂敏感,对金刚烷胺类呈耐药性.实验毒株HA基因序列与国内和国外毒株同源性为99.1％～99.7％.该地区流感毒株抗原变异程度较大,其中毒株HA发生14个氨基酸点位改变,分别为:A215E,D127E,E235K,E374K,G170E,H138R,L161I,I321V,L191I,P83S,R45K,S185T,S203T和V234I.其中第83位和第321位与国内代表株相同,但是与国外代表株不同.NA发生15个氨基酸点位改变,分别为A20V,N44S,V83M,V106I,E128G,H144Y,I188T,V241I,S247N,N248D,S334N,N369K,N449K,D451G和G454S.其中所有毒株均发生V106I和S247N的变化. 结论 通过对HA和NA基因序列对比分析,该地区流感疫苗对当地居民有保护作用,但是毒株与疫苗株间发生相对抗原漂移,需要进一步观察毒株变异情况.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 基因序列分析 疫苗评价 -
诺如病毒GⅡ.4型流行株基因序列分析和流行病学研究
目的 研究诺如病毒的基因特征和变化规律,预测诺如病毒的进化方向及流行趋势,为预防诺如病毒病的暴发打下良好基础. 方法 采用RNA提取试剂Trizol提取诺如病毒毒株RNA,采用试剂盒TaKaRa Ex TAP进行PCR扩增,利用Bioedit软件对基因序列进行拼接,然后对基因序列分析.将PCR扩增出的P区域克隆到表达载体,构建原核表达质粒.在大肠埃希菌中表达P蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测.以ABO血型健康人唾液为受体研究P粒子与唾液HBGA结合能力,检测方法采用间接ELISA法. 结果 实验用诺如病毒毒株与GⅡ.4流行株在RdRp区的核苷酸序列同源性达到94％以上,其中US95/96株94％,Farmington Hills株94.2％,Hunter株94.7％,Den_Haag_2006b株95.8％,Osaka_2007株96.5％,New_Orleans_2009株97.2％,Sydney_2012株98.4％.实验株与GⅡ.4流行株在衣壳蛋白区的核苷酸序列同源性达到94％以上,其中US95/96株94.3％,Farmington Hills株94.1％,Hunter株95.2％,Den_Haag_2006b株96.3％,Osaka_2007株96.8％,New_Orleans_2009株97.8％,Sydney_2012株98.6％;氨基酸同源性达到96％以上,其中US95/96株为96.1％,Farmington Hills株96.3％,Hunter株97.1％,Den_Haag_2006b株96.8％,Osaka_2007株97.3％,New_Orleans_2009株97.8％,Sydney_2012株98.9％.实验株在RdRp区核糖核苷酸序列的与New_orleans2009和Sydney_2012同源性较高,实验株中P2区氨基酸位点发生多点位定向突变,如P2区第95位由天冬酰胺(N)突变为组氨酸(H).重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测产物大小为35 ku的目的蛋白表达.检测P粒子与唾液HBGA结合能力(A450值)血型A为3.81～5.12;血型B为3.12～4.05;血型O为2.85～3.51. 结论 诺如病毒在遗传上具有多样性,变异快的特点,因而很难有疫苗对它长期安全有效.通过对GⅡ.4型基因序列的研究,有助于寻找其关键位点变化规律和流行株进化机理,有助于预测诺如病毒的进化方向及流行趋势.
关键词： 诺如病毒GⅡ.4型流行株 基因序列分析 流行趋势 -
鼠类感染钩端螺旋体的PCR检测和基因序列分析
目的 对宁波地区鼠类携带的钩端螺旋体进行PCR检测并分析其基因序列特征. 方法 设计、合成钩端螺旋体的secY基因和23S rDNA基因引物,对宁波梅山口岸2014年5-12月捕获的鼠类样品进行PCR检测,并进行核苷酸序列测定与系统进化分析. 结果 共检测72只鼠类肾样品,其中5只黑线姬鼠PCR检测阳性,分离获得钩端螺旋体株DXLP 1501,其secY基因扩增片段大小为285 bp,23S rDNA基因扩增片段大小为484 bp.系统进化分析显示,DX-LP1501 23S rDNA基因与博氏螺旋体株L550位于同一分支,遗传距离为0.005;DXLP1501 sec Y基因与5株博氏钩端螺旋体和1株梅氏钩端螺旋体位于同一分支,遗传距离为0.011. 结论 宁波地区鼠类中存在博氏钩端螺旋体感染,流行株DXLP501与致病性国际流行株高度同源.
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gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价
近研究发现,gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因.gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因,其显著优点是基因进化率较快,碱基替换频率较高,在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性.本实验以10株沙门菌为受试对象,用PCR方法同时扩增其16S rRNA和gyrB基因,通过基因序列分析,比较两种基因对沙门菌的鉴别能力.
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广州市环境及空调冷却水中釜山军团菌的分离与鉴定
目的 对广州市环境水源及中央空调冷却水中分离的两株疑似嗜肺军团菌进行分子生物学鉴定.方法 通过培养特征、生化反应特性、军团菌属特异性引物PCR鉴定、PCR-酶切分型方法,16S rRNA基因、mip基因和rpoB基因序列分析,确定两株疑似嗜肺军团菌的分类地位.结果 两株疑似嗜肺军团菌均为革兰氏阴性杆菌,在BCYEα平板上生长,36℃培养48 h可见白色菌落,氧化酶、明胶液化与马尿酸水解实验均为阳性,尿素酶、硝酸盐还原实验阴性,按表型特征极易鉴定为嗜肺军团菌.军团菌属特异性引物PCR扩增阳性,PCR-酶切分型结果为单一226 bp片段.16S rRNA基因、mip基因和rpoB基因序列比对与系统进化分析显示两株菌与釜山军团菌相似.结论 这是我国首次分离得到釜山军团菌,且同时存在于自然环境中和空调冷却塔水中;由于其生化特征,易错误鉴定为嗜肺军团菌,PCR-酶切分型与多基因鉴定的方法可有效鉴定釜山军团菌.
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北京地区新近报道的人Boca病毒VP1、VP2蛋白编码区基因序列分析
目的 了解北京地区新近报道的人Boca病毒(human bocavirus,HBoV)主要结构蛋白编码区基因的特征.方法 选择已经过初步研究证明为HBoV NP1基因检测为阳性的2份临床标本BJ3064、BJ3722,应用针对HBoV VP1蛋白编码区基因的PCR引物进行扩增,对所获得的PCR扩增产物直接进行核苷酸序列测定.将所测到的序列与GenBank中的基因序列进行比较分析和种系进化分析.结果 从标本BJ3064及BJ3722中扩增得到HBoV VP1蛋白编码区全基因的PCB扩增产物为2016 bp,编码671个氨基酸.VP2蛋白是在不改变开放性读码框架(ORF)的情况下,由VP1蛋白编码区内起始合成,并与VP1终止于同一终止密码子,长度为1629 bp,编码542个氨基酸.与HBoV原型株ST1、ST2株相比较,BJ3064、BJ3722的VP1及VP2蛋白无论是核苷酸水平还是氨基酸水平的同源性均超过98%,但与同属细小病毒的BPV及MVC相应位置的序列相比较,同源性较低,其中核苷酸序列同源性低于60%,而氨基酸序列同源性低于50%.VP1及VP2蛋白的编码区基因进化分析显示,BJ3064、BJ3722与ST2之间进化关系较ST1更密切.在BJ3064、BJ3722的VP1蛋白中,也存在类似于MVC的保守性磷酸酯酶A2特异性位点的活性基序(HDXXY)及Ca2+结合位点.结论 已得到HBoV的结构蛋白VP1和VP2的全基因,将为儿科急性呼吸道感染中该病毒的病原作用、地位及其在各年龄组人群中的血清学特征的深入研究打下坚实的基础.
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北京地区2株人偏肺病毒的P和M蛋白基因序列分析
目的进一步了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)编码基因的特征. 方法从分属于hMPV的两个不同基因进化簇(即基因型)的2份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增P和M全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序,与GenBank中的hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析. 结果经扩增BJ1816和BJ1887的P基因全长为885个核苷酸,编码294个氨基酸;M基因全长765个核苷酸,编码254个氨基酸.BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性(91.9%～100%).BJ1816和BJ1887间P基因的氨基酸同源性仅为85.8%,而M基因的氨基酸同源性为96.9%. 结论 BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似,不同型的hMPV的P基因之间比M基因显示了更强的基因多样性.
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北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析
目的进一步了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)编码基因的特征.方法在原先工作的基础上,从分属于hMPV的两个不同基因进化簇(即基因型)的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序,与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析.结果 BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸,编码539个氨基酸.BJ1816和BJ1887 F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83.8%和94.4%,与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性(98.3%～99.6%).BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白,具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点(RQSR).BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性(96.9% vs 93.8%);除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外,F1亚单位的其余部分较保守(95.4%);糖基化位点保守.种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇.结论 F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型,其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似,是病毒的膜表面糖蛋白,提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用.
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广东省登革病毒的分子流行病学研究
目的通过对广东省90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究，初步了解我国毒株的可能来源。方法采用RT-PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒(DEN)1型和2型NS1部分基因片段，然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较，并以核苷酸的差异在6%以上作为基因亚型分型的标准。结果①广州1991年分离的DEN1（GD03/91）与潮洲1995年分离的DEN1（GD23/95）同源性很高，为97%，属同一基因亚型，而两者与从潮洲1997年分离的DEN1（GD14/97）同源性均为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD03/91和GD23/95可能来自东南亚或瑙鲁等地，GD14/97可能来自新加坡。②佛山市1993年分离的DEN2（GD06/93）和南海市1998年分离的DEN2（GD01/98）同源性为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD01/98与泰国流行株ThNH-P28/93株共享序列非常接近，核苷酸同源性为98%，氨基酸同源性为100%，因此推测GD01/98可能来源于泰国。结论广东省90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。
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临床致病菌整合子检测及耐药基因盒序列分析
目的对临床菌株中的第一类整合子分布及其耐药基因盒的结构特征进行分析.方法应用PCR方法检测33株临床菌株中的第一类整合酶基因intI,并对intI阳性菌株整合的耐药基因进行测序及序列分析.结果 33株临床菌株(100%)均为第一类整合酶基因阳性.耐药基因盒特异PCR扩增发现,29株菌得到1 913 bp的扩增产物,2株得到1 664 bp的产物,1株得到1 009 bp的产物,1株得到1 913 bp和1 009 bp两种不同产物.序列分析结果表明,1 913 bp 的扩增产物携带基因盒dhfr、orfF和 aadA2,1 664 bp的扩增产物携带基因盒aadA5和dfr17,1 009 bp的扩增产物携带基因盒aadA2,aadA2 和aadA5均为编码对氨基糖苷类抗生素产生耐药的基因盒,dhfr和dfr17均为编码对磺胺类药物甲氧苄氨嘧啶产生耐药的基因盒;orfF为未知功能的开放阅读框.结论第一类整合子介导的耐药基因广泛存在于临床致病细菌中,提示要加强对耐药基因在细菌种属间水平转移的监测工作.
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溶血磷脂酸受体基因在大鼠心肌细胞的表达分析及3型受体亚型的克隆鉴定
目的 确定5种亚型溶血磷脂酸受体(LPAR)基因在大鼠心肌细胞中的表达,针对主要分布亚型LPAR3基因构建重组质粒.方法 利用实时荧光定量PCR和Western Blot检测LPA受体亚型在原代培养乳鼠心肌细胞的表达量；克隆LPAR3基因的编码区全序列,构建重组质粒.结果 在5种LPAR亚型中,LPAR3在心肌细胞中的表达高,其次为LPAR1,LPAR4和LPAR5在心肌细胞中的表达较低,而LPAR2则未检测到;Western Blot检测显示LPAR3的表达明显高于LPAR1的表达.对LPAR3基因进行序列分析,结果显示GenBank中序列号为NM_023969.1的序列与其它物种的该序列比较,缺失了一段保守的碱基片段；根据另一条序列(AB051164.1)设计引物,成功扩增LPAR3全基因片段,构建重组质粒.结论 LPAR3是大鼠心肌细胞中主要的溶血磷脂受体亚型; GenBank中序列号为NM_023969.1的LPAR3基因序列存在碱基缺失,大鼠中编码LPAR3的正确序列为AB051164.1.
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染色体显微切割技术的研究进展及应用(综述)
人类及许多高等动植物的基因序列分析研究,随着高度多态的DNA遗传标记的丰富和应用,取得很大的进步,但基因图中遗传标记分布不均,基因组的遗传图谱和物理图谱分辨率不高,染色体特定区域遗传标记密度不高,无法建立高精度基因图,需要一种新的方法探索新的标记,获得染色体区带特异性的序列标签位点(STS)及表达序列标签(EST)构建克隆连锁群,分阶段有序地完成特异区带全序列分析,染色体显微切割技术在此方面显示出特有的优越性.自八十年代初首次应用以来,显微切割技术通过不断的与其他分子生物学技术相结合,已在人类及动植物的病理研究,文库构建,基因定位,克隆等领域广泛应用,并取得瞩目的成绩.
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射干及类似药用植物叶绿体rbcL基因序列分析
目的对射干Belamcanda chinensis (L.) DC.,鸢尾Iris tectorum Maxim.,野鸢尾I.dichotoma Pall.,蝴蝶花I.japonica Thunb.和德国鸢尾I.germaica L.等5种药用植物进行叶绿体rbcL基因序列分析,并对其亲缘关系进行探讨.方法 CTAB(Cetyl trimelhyl ammonium bromide,CTAB)法提取总DNA,用作者设计的引物对鸢尾科5种药用植物的叶绿体rbcL(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylose Large Gene,rbcL)基因进行扩增,PCR扩增产物纯化后,用ABI310 DNA自动测序仪测序.结果获得射干和4种鸢尾属药用植物叶绿体rbcL基因部分序列(约750 bp),除德国鸢尾外, 其余4种药用植物的rbcL基因序列为首次获得;用clustal 8.0,MEGA 2.0等软件分析统计获得的目的基因片段,得到碱基突变点,遗传距离[碱基差异数(1.000～20.000)、颠换数为(0.000～9.000)、转换数为(0.000～14.000)],根据rbcL基因部分序列数据建立分子系统树.结论根据叶绿体rbcL基因序列数据可以很好的鉴别5种鸢尾科植物.
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心血管疾病基因表达芯片研究进展
基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一种高效的基因检测技术,这种技术可同时快速地分析大量的基因信息.基因芯片技术目前已经应用于基因序列分析、基因突变检测、新基因的发现、基因表达谱分析、基因组研究以及疾病的诊断、治疗和预防、药物研究与开发等许多领域.
