首页 > 文献资料
-
黄病毒多功能酶NS3研究进展
黄病毒非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白,其N端为丝氨酸蛋白酶结构域,C端为RNA解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA 5'三磷酸酶结构域.NS3在病毒前体蛋白的加工和病毒基因组的复制过程中发挥重要功能.对NS3的研究有助于新型疫苗和抗病毒药物的设计.本文试图对近年来NS3研究的进展情况进行一简要的回顾.
关键词： 黄病毒 NS3 蛋白酶 解旋酶 核苷三磷酸酶'RNA 5'三磷酸酶 -
HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展
丙型肝炎病毒感染显著的特征是慢性化,已经成为严重的社会公共卫生问题.目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,持续疗效有限而且副作用大,因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物.HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性,在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用.因此,NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物.本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下.
-
Zika病毒NS3具有依赖于ATP水解的dsDNA解链活性
目的 研究Zika病毒NS3蛋白是否具有依赖于ATP水解的dsDNA解链活性.方法 构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika NS3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对NS3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振能量转移(FRET)原理,对NS3的dsDNA解链活性进行实时动力学检测;利用定点突变方法将NS3蛋白的第198位甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A),得到G198A突变体,检测其是否影响NS3解旋酶活性.结果 Zika NS3蛋白在体外可以水解ATP,酶解大反应速率为2.76 μmol/(L· min),Km值为0.11 mmol/L;Zika NS3蛋白在体外可以解链dsDNA;G198A突变体与野生型相比,ATP水解速率和dsDNA的解链速率均明显减弱.结论 Zika NS3蛋白在体外具有ATP水解活性以及dsDNA解链活性,且第198位甘氨酸对于NS3酶活性至关重要.
-
UvrD解旋酶通过牵动RNA聚合酶反向运动促进DNA修复
以往的研究表明，UvrD解旋酶与核苷酸的切除修复功能相关，但其机制并不明确。美国纽约大学的Epshtein等人在近期的研究中揭示了大肠杆菌UvrD解旋酶在核苷酸切除与修复中所扮演的具体角色。
大肠杆菌UvrD解旋酶与RNA聚合酶在转录延长过程相结合，利用其解旋／延长活性，强制使RNA聚合酶沿DNA链反向滑动。通过诱导RNA聚合酶的反向运动，UvrD使DNA原先被遮盖住的损伤区域暴露，从而使核苷酸切除修复的相关酶能够顺利结合到损伤区域上。实验结果表明，UvrD解旋酶是对基因完整性起到极大正面意义的转录延长因子。 -
丙型肝炎病毒解旋酶活性高通量筛选模型的建立
目的 建立丙型肝炎病毒(HCV)解旋酶抑制剂高通量筛选模型,筛选抗HCV药物. 方法 应用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的解旋酶活性,并对反应温度、反应缓冲液pH、解旋酶浓度、底物浓度、ATP浓度等反应条件进行优化,建立筛选模型优化反应体系,通过Doxorubicin对反应体系进行验证. 结果 优化的解旋酶模型测定反应体系和条件为:反应温度为22℃,反应缓冲液pH值为7,酶浓度为5 μg/ml,底物浓度为5 nmol/L,ATP浓度为2.5 mmol/L.用优化的FRET测得2μmol/L Doxorubicin对解旋酶的抑制率为(59.1±17.4)％. 结论 建立了HCV解旋酶抑制剂FRET法高通量筛选模型,为新型HCV NS3解旋酶抑制剂的研发奠定了基础.
-
gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价
近研究发现,gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因.gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因,其显著优点是基因进化率较快,碱基替换频率较高,在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性.本实验以10株沙门菌为受试对象,用PCR方法同时扩增其16S rRNA和gyrB基因,通过基因序列分析,比较两种基因对沙门菌的鉴别能力.
-
宿主限制性因子MOV10对HBV复制的影响
目的 研究宿主限制性因子莫罗尼白血病病毒10蛋白(Moloney leukemia virus 10,MOV10)对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的调控作用.方法 首先在肝癌细胞Huh7中转染HBV复制质粒,探讨HBV复制和MOV10表达的相关性;接着在Huh7中通过siRNA干扰或过表达MOV10,提取病毒核心颗粒的DNA,通过荧光定量PCR分析病毒复制水平的变化;进一步构建MOV10保守结构域Ⅱ的酶活突变体(D645A、E646Q和G648A),检测突变后对MOV10抗病毒作用的影响;在人肾上皮细胞293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)研究MOV10与HBV RNA的结合.结果 肝癌细胞Huh7转染HBV复制质粒后,MOV10蛋白水平增高;肝癌细胞Huh7中干扰内源性MOV10后,HBV复制水平升高1.5倍,而Huh7细胞中过表达MOV10,显著抑制了HBV的复制;MOV10结构域Ⅱ突变体同样显著抑制HBV的复制;MOV10可以与HBV 3.5 kb RNA结合.结论 在肝癌细胞中,宿主限制性因子MOV10的表达与HBV复制相关,其抑制HBV复制的作用不依赖于其解旋酶活性,可能与HBV 3.5 kb RNA结合有关.
-
DDX3作为一个强效预后标志物其下调可以促进结直肠癌的转移
DEAD box RNA解旋酶在RNA代谢中发挥重要作用，DEAD box多肽3（ DDX3）作为DEAD box RNA解旋酶家族中一员，参与mRNA拼接、转录和翻译。但DDX3对于肿瘤的作用并不明确，DDX3的肿瘤抑制作用和促进作用均有报道，有趣的是即使在同一种肿瘤类型中，DDX3发挥的作用也可能变化，其矛盾之处引起人们关注。 DDX3在多种肿瘤中存在，并且通过复杂的方式调控肿瘤进展。近期在Oncotarget发表的一篇文章探讨了DDX3对结直肠癌的预后意义并进一步研究了其在肿瘤进展过程中的意义。
-
一低剂量辐射诱导新基因的转录调控和初步功能分析
目的克隆低剂量辐射诱导基因,研究辐射对其转录调控作用和生物学功能.方法用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因,用RACE技术获取cDNA旁侧序列,Northern杂交分析基因的转录调节,生物信息学分析基因的结构和功能.结果获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LRIGx的cDNA片段,序列同源性比较显示与人染色体20q11.2-12一段DNA高度同源(>99%).Northern杂交结果揭示该基因转录子全长约8.5 kb,在0.2 Gy照射后2 h出现诱导表达,4 h后转录子水平为对照细胞的5倍多,也受0.02 Gy更低剂量照射诱导表达.2 Gy大剂量照射后1 h出现短暂诱导表达,但不如低剂量照射明显,2 h后恢复正常水平.生物信息学分析结果显示该基因编码产物含有解旋酶活性保守区.结论分离鉴定出一低剂量辐射反应基因,其编码蛋白可能参与DNA代谢(如修复)等细胞辐射反应过程.
-
丙型肝炎基因治疗的现状与前景
背景丙型肝炎病毒(HCV)是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的主要原因之一.近年来对HCV分子生物学属性的研究集中在对病毒复制、HCV基因及病毒蛋白结构和功能方面.HCV基因治疗的发展是基于HCV功能基因组学的发展,HCV为单链RNA病毒,包括5′非编码区(NCR)、核心区(C)及非结构区(NS),其中5′-NCR中内核糖体进入基序(IRES)启动病毒基因翻译,NS3具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶的功能,NS5B具有聚合酶的功能,在HCV复制中起重要作用,也是HCV基因治疗的重要靶位点.
-
癌症与衰老的分子生物学关系的研究进展
癌症是一种与衰老有关的疾病，在中老年人中癌症发病率很高。衰老生物学与癌症生物学存在着许多相似的特征，癌症与衰老的分子学机制又有着相互重叠的方面。因此，有关衰老的细胞及分子生物学机制的研究对于癌症的发生机制和抗肿瘤研究均具有重要价值。本文从DNA损伤修复、端粒（ telomere）及端粒酶（telomerase）、RECQL4（属于人类RECQ解旋酶家族）、表观遗传学和自噬五方面，就衰老与癌症的细胞及分子生物学相关性的新研究进展进行综述。以期为开发新抗肿瘤药物、治疗衰老相关的疾病提供依据。
-
核酸等温扩增技术研究进展
核酸扩增技术是生物医学领域病原体确认的常用检测技术.近年新发展起来的核酸等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比PCR技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景.在众多等温扩增技术中,环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用,其他一些新发展起来的等温扩增技术,如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术,也在不断发展与完善之中.为了更好地有选择地开发利用这方面技术,现就这些等温扩增技术的原理、特点及其在疾病检测中的应用进行综述.扩增.整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成.
-
丙型肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达研究
目的在大肠肝菌中表达完整的丙型肝炎病毒的解旋酶.方法用异硫氰酸胍法从HCV阳性的病人血清中提取RNA,经RT-PCR法扩增出NS3区的基因片段,将其克隆入PQE30表达载体中转化大肠杆菌XLI-Blue进行表达.表达出的蛋白用western blot方法鉴定.结果扩增出的基因片段大小为1350 bp,表达出的蛋白分子量为52 KD,经Western blot鉴定为阳性.结论成功地在大肠杆菌中表达出完整的HCV解旋酶蛋白,为HCV的诊断和疫苗研究奠定了基础.
-
抗HCV解旋酶人源性单链噬菌体抗体的筛选
目的从人源性单链噬菌体抗体库中筛选出针对HCV解旋酶的单链抗体并测定其序列.方法以解旋酶蛋白为抗原,经过五轮的吸附-洗脱-扩增,从噬菌体抗体库中筛选出特异性的单克隆抗体.用ELISA、交叉反应性ELISA、竞争抑制ELISA实验鉴定其特异性后将此抗体基因克隆进PBluescript质粒中测定其序列.结果经过淘筛解旋酶蛋白对抗体库中的噬菌体进行了特异性富集.经鉴定此抗体为特异的抗HCV解旋酶的单克隆抗体,将其测序可见其基因为人源性的单链抗体基因.结论所得的人源性单链抗体免疫性小,穿透性强,可以大批量生产,是诊断和导向治疗的理想载体,并为进一步的表位研究、疫苗设计提供了基础.
-
解旋酶DDX41在人牙髓组织及牙髓细胞中的表达
目的：研究解旋酶DDX41在人牙髓组织和细胞中的表达，为深入探讨其在龋病及牙髓病天然免疫应答过程中的作用奠定基础。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学和免疫组织化学技术对人牙髓组织和牙髓细胞中DDX41的表达和定位进行分析。结果 RT-PCR结果显示DDX41 mRNA在人牙髓细胞中有显著表达；免疫细胞化学和免疫组织化学染色结果显示DDX41在牙髓细胞的胞浆和胞核中皆有表达，但胞核中的表达水平较低；在牙髓组织中，DDX41主要在牙髓组织表面的成牙本质细胞的胞浆和胞核中皆有表达。结论人牙髓组织中的成牙本质细胞作为牙髓免疫的效应细胞之一，在龋病和牙髓炎的免疫反应过程中，细胞内可能存在DDX41/STING依赖的TBK1-IRF3-IFN-β信号通路的活化。
-
改良石墨烯检测体系对手足口病常见病毒的快速检测
目的 推动临床手足口病的早期诊断,实现对导致手足口病2种常见病毒的快速检测.方法 本研究利用氧化石墨烯对荧光淬灭和DNA特异结合特点,在氧化石墨烯中加入2种不同荧光标记的FDNA,通过创造性的引入解旋酶和ATP提高检测体系的灵敏度,构建双重RecQE+ ATP-FDNA-BDNA-GO检测体系,并对该体系中解旋酶和ATP适使用浓度进行优化.结果 在不经过PCR扩增情况下,将所构建的石墨烯检测体系成功用于体外柯萨奇病毒CA16和肠道病毒EV71特异性的检测.本研究通过对传统石墨烯检测体系的改进和优化,优化后的检测体系对CA16-cDNA和EV71-cDNA的检测下限分别0.36 nmol/L和0.29 nmol/L.结论 所构建的检测体系可将柯萨奇病毒CA16和肠道病毒EV71的检测时间缩短至2h,对临床手足口病的及时诊断预防有重要的借鉴意义.
-
HCV NS3解旋酶基因原核表达载体pGEX-4T-1的构建
[目的]构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3解旋酶基因原核表达载体,为进一步研究和解析NS3的解旋酶基因对病毒复制的机制准备条件.[方法]将含有NS3基因的pMD-24/HCV NS3质粒转化感受态菌DH-5α并扩增;提取pMD-24/HCV NS3质粒;从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出NS3解旋酶基因;并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与表达载体pGEX-4T-1重组,以得到重组的原核表达载体pGEX-4T-1/NS3解旋酶.[结果]从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出的NS3解旋酶基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列:电泳结果证明已将此片段克隆到pGEX-4T-1内.[结论]成功地构建了HCV NS3解旋酶基因的原核表达载体DGEX-4T-1/NS3解旋酶.
-
HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析
目的制备针对丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体(MAb),并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具.方法用原核表达的HCV 非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3 蛋白的MAb.用间接免疫荧光法和Western blot鉴定其特异性.分别构建NS3丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白的N末端1/3)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ns3p、NS3解旋酶(NS3蛋白的C末端2/3)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ns3h,将其瞬时转染COS-7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域.结果获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域.结论获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础.
-
嗜麦芽窄食单胞菌对氟喹诺酮类抗菌药的分子耐药机制研究
目的:研究嗜麦芽窄食单胞菌拓谱异构酶II和IV的突变与氟喹诺酮类药物的耐药关系,为新药开发提供实验依据.方法:选择对环丙沙星MIC>2mg/L且主动外排机制阴性的菌株,对其gyrA和parE的喹诺酮决定区域基因分别进行PCR扩增,纯化后直接测序.结果:嗜麦芽窄食单胞菌在DNA解旋酶常见的83位和87位没有突变,同时在GyrA的整个QRDRs没有氨基酸的改变,并且其83位是Gln而不是其它革兰阴性菌常见的Ser或Thr.5株菌中的parE各有1株菌在402和432突变,但是该突变与FQNS耐药不相关,未观察到Valdezate研究中的1/2菌株的parE突变频率高且主要集中在437,465,477和485位的现象.结论:嗜麦芽窄食单胞菌对FQNS耐药与主动外排泵有关,可能与外膜的通透性降低有关,但与DNA解旋酶和拓谱异构酶IV的靶位点改变关系尚不明确,需进一步研究.
