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乙型脑炎病毒sA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达
以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14-14-2的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增其NS 1基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,得到克隆质粒pMD18-T-NS1.pMD18-T-NS1经EcoRI和SalI酶切后,回收NS 1片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)EcoRI/SalI位点,构建了重组原核表达质粒pET-28a(+)-NS1.转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得高效表达,产物经SDS-PAGE电泳结果显示,表达产物分子量约为45kD.Western blottmg分析表明表达产物具有抗原活性.
关键词： 乙型脑炎病毒 NS1基因 反转录一聚合酶链反应 克隆 表达 -
H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析
利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.
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N-糖基化对乙型脑炎病毒prME和NS1基因免疫效果影响的研究
prME和NS1为乙型脑炎病毒两个主要的免疫保护蛋白,且均为N-糖蛋白.为研究N-糖基化对乙型脑炎病毒免疫保护的作用,本研究用PCR介导的定点突变方法,分别消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的不同N-糖基化位点,并构建了prME和NS1突变基因的真核表达质粒.将质粒免疫四周龄雌性小白鼠,经两次免疫后,采集血清检测体液免疫反应,后对小鼠用强毒进行攻击,观察并记录免疫保护力.研究结果显示,与野生型prME基因免疫组相比,消除单个糖基化位点后prME基因诱导的ELISA抗体、中和抗体和免疫保护力均略有升高,而同时消除两个糖基化位点的则会降低.NS1基因消除单个糖基化位点后保护率高达到100％,但消除两个糖基化位点后则免疫保护率略有降低(75％).通过本研究证明,N-糖基化在维系乙型脑炎病毒prME和NS1蛋白的免疫保护中具有重要的作用,单个糖基化的缺失可增强蛋白的免疫原性,而两个糖基都缺失后,则造成了免疫效率的降低.
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猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立
以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPV NS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1.电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性.将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原佳包被浓度为1.9 μg/mL,血清佳稀释度为1:80,阳性判断标准定为OD待检血清＞0.4且OD待检血清/OD标准阴性值＞2.0.用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2％,与国外同类试剂盒的符合率为92.1％,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测.
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究
通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1.将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达.经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡.
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登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究
目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,追踪传染源,为疾病的预防控制提供实验室依据.方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析.结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸,并分离到登革2型病毒;浙江省登革2型病毒分离株(ZJ/01/04)与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian/10/99株和Saudi/92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97.1%、99.2%和99.6%,而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.7%、66.9%和63.6%.基因进化树显示ZJ/01/04分离株与Saudi/92株亲缘关系近,在进化树的同一分支上.结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起,该毒株有可能来源于沙特阿拉伯.
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登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察
目的观察登革3型病毒的prM-E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据. 方法将登革3型病毒的prM-E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxic T-lymphocytes)杀伤率. 结果混合重组质粒DNA免疫组与单一prM-E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第14天检测到中和抗体,在第33天达到高峰,为1∶32.在末次免疫后第41天,当效靶比为40∶1时,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为15%,而2个单质粒DNA组分别为10.9%和12.4%. 结论重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果.
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广东省登革病毒的分子流行病学研究
目的通过对广东省90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究，初步了解我国毒株的可能来源。方法采用RT-PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒(DEN)1型和2型NS1部分基因片段，然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较，并以核苷酸的差异在6%以上作为基因亚型分型的标准。结果①广州1991年分离的DEN1（GD03/91）与潮洲1995年分离的DEN1（GD23/95）同源性很高，为97%，属同一基因亚型，而两者与从潮洲1997年分离的DEN1（GD14/97）同源性均为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD03/91和GD23/95可能来自东南亚或瑙鲁等地，GD14/97可能来自新加坡。②佛山市1993年分离的DEN2（GD06/93）和南海市1998年分离的DEN2（GD01/98）同源性为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD01/98与泰国流行株ThNH-P28/93株共享序列非常接近，核苷酸同源性为98%，氨基酸同源性为100%，因此推测GD01/98可能来源于泰国。结论广东省90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。
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两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析
目的对从登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)病人血清分离到的一株登革2型病毒(dengue virus type 2, DEN-2 B株)和DEN-2 NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析,了解其变异及分子进化特征.方法利用RT-PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段,PCR产物直接测序;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树.结果 B株与NGC株E蛋白基因区第1～476nt(476bp)碱基序列存在8个位点的差异;编码氨基酸存在4个位置的不同;NS1基因区第589～1002nt (413bp) 碱基序列存在7个位点的差异,编码氨基酸有2个位置的改变;B株与NGC株和DEN-2 44株E区部分片段核苷酸同源性分别为99.1%和98.7%;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为98.3%和98.1%.B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank,注册号分别为AY179733和AY238471.结论 B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异;B株与我国海南1989年流行的DEN-2 44株和NGC株系统进化关系较近.
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两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较
目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.
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登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察
目的:构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒,观察其免疫原性,为登革新型疫苗的研究提供依据.方法:从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA,经RT-PCR获得NS1基因片段,然后将其克隆到真核表达载体中.用电穿孔法将重组质粒DNA转入COS7细胞,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达.将重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠,观察其免疫原性.结果:通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体.用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光.重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答.结论:含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达,而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答.
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2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析
目的 鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virus I,DENV I)分离株的NS1基因.方法 采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENV I的NS1基因,进行测序.应用BIOEDIT软件比对NS1及DENV I标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析.应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树.结果共分离获得16株DENVI的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M.16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变.16株分离株与2011-ChinaDonggua (JQ048541.1)、2008-Singapore (GU370049.2)、2014-Taiwan (KU365900.1)、2005-ChinaFujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia (KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-SouthKorea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系.结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENV I,可能属于东南亚国家的输入性毒株.
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抗流感病毒NS1蛋白抗体的制备及其生物特性研究
目的 NS1蛋白在流感病毒复制和传播中起到重要的调节作用,其功能多样,如能调节宿主细胞的蛋白合成、诱导感染细胞的凋亡以及拮抗IFN作用等,此外还有许多功能至今尚未明了.因此,研制一个特异性高的抗NS1抗体,对NS1蛋白功能的进一步研究起到重要作用.方法 RT-PCR扩增流感病毒NS1基因,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+)中.然后在大肠埃希菌BL21中表达,用切胶纯化方法获取NS1融合蛋白.用该蛋白免疫新西兰大白兔,制备效价较高的多克隆抗体,并测定其效价(间接ELISA法).用病毒感染细胞实验、Western印迹法和间接免疫荧光实验等方法,观察病毒复制过程中NS1蛋白的表达及细胞定位情况.结果 首先构建了能表达NS1蛋白的质粒,并经原核细胞表达获得了NS1蛋白.然后用该蛋白免疫大白兔,获得了效价较高(1∶256 000)的抗NS1蛋白抗体.实验发现,该抗体可以特异性结合非依赖亚型的甲型流感病毒NS1蛋白.病毒感染后6h即可以检测到NS1蛋白,随着病毒复制时间的延长NS1蛋白表达量变化不明显；24h后NS1蛋白主要分布于细胞核内并能定位于核仁中,也有部分位于细胞质.结论 本研究通过原核表达获得了NS1蛋白,并利用常规的免疫方法获得了效价较高的抗NS1多克隆抗体.所制备的多克隆抗体能够有效定位NS1蛋白的表达,并且能和甲型流感病毒各亚型结合,具有较高的特异性.该抗体不仅能用于NS1蛋白功能及其对宿主细胞影响的研究,而且可用于鉴别诊断猪或其他动物中的病毒感染还是接种疫苗后的反应,有较好的开发应用前景.
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2015-2016年深圳市登革Ⅲ、Ⅳ型分离病毒株E/NS1基因序列特征
目的 了解2015-2016年深圳市分离的登革Ⅲ、Ⅳ型病毒E/NS1基因序列特征及登革Ⅲ、Ⅳ型病毒流行规律,探究其可能的传播来源.方法 收集2015-2016年深圳市登革热患者病例资料及急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,用FQ-PCR对其进行血清分型,分离成功的病毒株用反转录-聚合酶链反应(PCR)方法扩增E基因和NS1基因,进行序列分析,绘制系统进化树,氨基酸比对分析4个不同血清型NS1蛋白.结果 从5份Ⅲ型的登革病毒标本中成功分离4份病毒株,3份Ⅳ型登革病毒标本中成功分离2份登革病毒;BLAST分析保守E基因结果表明,与DENV-3分离株同源性高(99％)的毒株主要是印度尼西亚2010和2015年分离株、菲律宾2015年分离株.与DENV-4分离株同源性高(99％)的毒株主要是菲律宾2013年分离株、印度尼西亚2010分离株、意大利2009年分离株.NS1基因序列分析显示所选4株不同血清型的病毒株氨基酸相似性为77.69％,4个不同血清型的登革热NS1抗原存在5-7个氨基酸保守区域.结论 2015-2016年深圳市输入的登革Ⅲ、Ⅳ型病毒可能来自印度尼西亚和菲律宾,应加强出入境人员的监测工作,避免输入引起本地感染的风险.
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达
目的 构建大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,将H5N1亚型禽流感病毒NS1基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达,表达产物用Western blot进行检测分析.方法 酶切含有NS1基因的质粒pUC-NS1,分别克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和杆状病毒转移载体pFastBacHT A中,分别获得表达载体pET-NS1和pFast-NS1.将pET-NS1转化大肠杆菌BL21,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;将pFast-NS1转化DH10Bac感受态细胞,提取重组Bac-NS1 DNA,以M13为通用引物作PCR鉴定,阳性Bac-NS1用脂质体转染sf9细胞,72 h后收集感染细胞.大肠杆菌表达产物和细胞表达产物分别裂解后作SDS-PAGE和Western blot分析.结果 成功构建了大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,大肠杆菌和昆虫细胞中表达的融合蛋白Western blot都能检测到特异性条带.结论 NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中得到成功表达,为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备奠定了基础.
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2010年浙江省输入性登革2型病毒分子特征研究
目的:为确证2010年浙江省输入性疑似登革热病例病因,分析病原的分子特征并进行溯源.方法:对患者血清标本分别检测登革IgM抗体、病毒核酸和病毒分离.对分离株E和NS1基因测序,并进行同源性和进化分析.结果:从血清中检测到登革IgM抗体和登革2型核酸,并分离到登革2型病毒株(ZJ/02/10)；浙江登革2型分离株与标准株NGC在E基因的核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性分别为94.7％和97.6％,而与登革1、3、4型的nt同源性分别为65.3％、64.3％和65.9％.ZJ/02/10株与菲律宾PHI/St68/00株E基因nt和aa同源性高,进化树显示二者亲缘关系近.NS1基因进化树结果与E基因相似.结论:从血清学、病原学和分子特征均证实输入性疑似登革病例由登革2型病毒引起,该毒株有可能来源于菲律宾.
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流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建
为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因.测序显示H5N1亚型流感病毒NS1 cDNA全长678bp,编码225个氨基酸.BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性.之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1 cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上.经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别.该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础.
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猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析
对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽.该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为99.7%、99.5%、99.5%、96.7%.PPV SD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPV NS1的进化树分析表明:PPV SD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系近,与BPV3 NS1的亲缘关系远;在Thr435和Ser473位点PPV SD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPV SD-68株NS1潜在的磷酸化位点.
关键词： 猪细小病毒SD-68株 NS1基因 进化树 -
广东省中山市登革Ⅰ型病毒的分离鉴定及E/NS1基因序列分析
目的 分离鉴定中山市2007年及2012年流行的登革病毒,从分子水平分析其地域来源和系统进化情况.方法 用C6/36细胞分离10份2007年登革病毒特异性IgM抗体阳性血清和4份2012年登革病毒核酸阳性血清中的病毒,采用Real time-PCR对毒株进行血清型鉴定,RT-PCR扩增毒株E/NS1基因并进行序列测定,分析其与不同区域流行株和国际标准株的同源性和系统进化情况. 结果 共分离鉴定到6株登革Ⅰ型病毒,其中2株为2007年流行株,4株为2012年流行株,分别命名为2007ZSDengue1-2和2012ZSDengue1-4.2012ZSDengue1-2与柬埔寨、越南等东南亚国家近年流行的登革Ⅰ型毒株相似性高(大于99.0％),进化距离短(0.011～0.012).2012ZSDengue3-4,2007ZSDengue1-2与广东省珠海市2007年流行和新加坡、日本、泰国等亚洲国家近年流行的登革Ⅰ型毒株相似性高(大于99.0％),进化距离短(0.007～0.024).中山流行株与登革Ⅰ型国际标准株、非洲和美洲流行株相似性在90.0％ ～94.0％之间,进化距离较远(0.065～0.108)；与登革Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型国际标准株NGC、H87、H241相似性约为68.0％、66.0％、71.0％,进化距离远(0.369～0.505). 结论 中山市2007年及2012年流行株为登革Ⅰ型病毒,可能属于东南亚国家输入性毒株,但输入源头有所不同.
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登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析
目的克隆登革 2型病毒 (DEN2)全长 NS1基因,构建 NS1基因的真核表达重组质粒.方法用 RT- PCR技术扩增 DEN2( NGC株)全长的 NS1基因序列,并定向克隆入 pPICZα B的 KpnⅠ /XbalⅠ位点,构建真核表达载体 pPICZα B- NS1,转化 E.coli DH5a菌.阳性重组质粒用 PCR、酶切及序列测定等方法鉴定.结果阳性质粒经 PCR及 KpnⅠ /XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为 1 134bp的基因;序列测定证实该基因与 DEN2( NGC株 AF038403) NS1基因序列有 99%同源.结论成功构建了含有 DEN2全长 NS1基因的真核表达载体 pPICZα B- NS1,为 NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础.
