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从N-糖基化探讨重症肌无力脾气虚证患者唾液淀粉酶活性改变机制
目的:检测重症肌无力脾气虚证患者酸负荷前后唾液淀粉酶(sAA)活性改变情况,并从sAA N-糖基化角度探讨重症肌无力脾气虚证sAA活性改变的机制.方法:收集36名健康(健康组)志愿者和30例重症肌无力脾气虚证患者(脾气虚组)酸负荷前后的唾液,Bernfeld法检测唾液sAA活性;Western blot法检测酸负荷前后唾液sAA蛋白表达,从糖基化蛋白表达条带的“有”或“无”判断sAA N-糖基化情况;凝集素亲和沉淀法检测sAA与刀豆凝集素(conA)结合率,以观察sAA高甘露糖型及杂合型糖链含量;凝集素亲和层析法检测sAA三种糖链(糖基化程度从高到低分别为复合型、杂合型、高甘露糖型)所占比例,以判断sAA糖基化程度.结果:与健康组比较,脾气虚组酸负荷前后sAA活性比值(后/前)降低(P＜0.05);43.3％ (13/30)的脾气虚患者在酸负荷前后均出现sAA糖基化蛋白条带缺失,高于健康组的13.3％(4/36,P＜0.05);脾气虚组酸负荷前sAA与conA结合率高于健康组(P＜0.05),提示其高甘露糖型及杂合型糖链所占比例增高;健康组弱结合峰与未结合峰(含复合型糖链)峰面积大于脾气虚组(P＜0.05);脾气虚组强结合峰(以高甘露糖型及杂合型糖链为主)峰面积大于健康者组(P＜0.05);提示脾气虚组sAA高甘露糖型及杂合型糖链构成比高于健康组.结论:N-糖基化不完全可能是重症肌无力脾气虚症患者sAA活性改变的主要影响因素之一.
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N-糖基化对乙型脑炎病毒prME和NS1基因免疫效果影响的研究
prME和NS1为乙型脑炎病毒两个主要的免疫保护蛋白,且均为N-糖蛋白.为研究N-糖基化对乙型脑炎病毒免疫保护的作用,本研究用PCR介导的定点突变方法,分别消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的不同N-糖基化位点,并构建了prME和NS1突变基因的真核表达质粒.将质粒免疫四周龄雌性小白鼠,经两次免疫后,采集血清检测体液免疫反应,后对小鼠用强毒进行攻击,观察并记录免疫保护力.研究结果显示,与野生型prME基因免疫组相比,消除单个糖基化位点后prME基因诱导的ELISA抗体、中和抗体和免疫保护力均略有升高,而同时消除两个糖基化位点的则会降低.NS1基因消除单个糖基化位点后保护率高达到100％,但消除两个糖基化位点后则免疫保护率略有降低(75％).通过本研究证明,N-糖基化在维系乙型脑炎病毒prME和NS1蛋白的免疫保护中具有重要的作用,单个糖基化的缺失可增强蛋白的免疫原性,而两个糖基都缺失后,则造成了免疫效率的降低.
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HBsAg和抗HBs双阳性慢性HBV感染患者S区主要亲水区新增N-糖基化突变与肝细胞癌发生风险的相关性研究
目的 探讨临床HBsAg和抗HBs双阳性(简称双阳性)慢性HBV感染患者病毒S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变与肝细胞癌(HCC)发生的相关性.方法 纳入2009年7月-2015年6月在解放军302医院就诊的284例双阳性慢性HBV感染患者,通过巢式PCR方法扩增血清样本HBV S基因全序列并进行测序,分析MHR新增糖基化突变和其他临床指标与HCC发生的相关性并动态分析18例双阳性HCC患者临床确诊HCC前后S区新增N-糖基化的突变情况.结果 多因素分析表明,患者年龄＞40岁、HBsAg＞中位数、HBeAg阴性和MRH新增N-糖基化突变是双阳性慢性HBV感染患者发展为HCC的危险因素(分别为OR=4.281,95％CI 1.843～9.941,P=0.001;OR=3.146,95％CI 1.633～6.060,P=0.001;OR=2.097,95％CI 1.010～4.357,P=0.047;OR=4.381,95％CI 1.842～10.417,P=0.001),而丙氨酸氨基转移酶(ALT)、抗HBs＞中位数、抗HBe阳性和HBV DNA水平与HCC发生均无显著相关性.动态研究结果表明,18例双阳性HCC患者样本中有8例在发生HCC 1～4年前已携有新增N-糖基化突变.结论 在双阳性患者中HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HCC发生密切相关,HBsAg和抗HBs双阳性叠加MHR新增糖基化突变可作为慢性HBV感染患者HCC发生风险的预测指标.
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HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的意义
目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义.方法 对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析.对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究.构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响.结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3％(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9％(9/314)(P＜0.01).HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9％(15/32)和22.6％(57/252) (P＜0.01).从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s 131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0％、2.0％和2.5％,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6％,但无sP120缺失+G145D联合突变.与野生株相比,新型突变株复制力提高31％,但HBsAg定量降低99％.免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响.结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性.
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隐匿性HBV感染患者HBV S基因N-糖基化突变对HBsAg抗原性影响的分析
目的 分析隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要亲水区(MHR)N-糖基化突变的抗原性,探讨N-糖基化突变与OBI发生机制的关系及临床意义.方法 选取2例OBI患者血清中检出的4种NXT/S形式突变,其中sQ129N为已知经典的N-糖基化突变,其余3种为本课题组新发现的突变,采用前期构建成功的野生型及突变型S基因重组质粒转染HepG2和Huh7细胞,验证3种新型突变形式,并分析4种突变对HBsAg抗原性的影响及这些突变地6种HBsAg检测试剂的反应性.结果 Western blotting结果证实3种新型突变均为N-糖基化突变.激光共聚焦结果显示,与野生株相比,4种突变株HBsAg/His标签的荧光强度比值分别降低了76.3％、53.4％、67.1％和52.7％,双抗体夹心法得出结果类似.用6种HBsAg临床试剂进行的检测结果显示,与野生株相比,3种新型突变株对6种HBsAg试剂的反应性均明显降低(P＜0.05);其中携带双N-糖基化突变(aa113-118 TSTTST→NST+aa131-133 TSM→NST)的HBsAg抗原性降低为明显,导致测试的6种试剂中4种无法检测到该突变蛋白.结论 HBV S基因MHR区N-糖基化突变抗原性降低是引起患者OBI表现的主要原因之一,目前临床常用的HBsAg检测试剂对突变抗原的检测敏感性仍需要进一步提高.
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过表达N－糖基转移酶的糖基工程酵母构建
目的：通过过表达N－糖基转移酶，构建1株糖基化修饰效率更高的糖基工程酵母。方法利用尿嘧啶（URA3）营养缺陷型筛选标记，在糖基工程酵母4－32中转入醇氧化酶1（alcohol oxidase 1，AOX1）启动子控制的利士曼原虫N－糖基转移酶星状孢子素和温度敏感性酶3（staurosporine and temperature sensitivity 3，STT3）D亚基，通过SDS－PAGE、Western印迹和肽N－糖苷酶F（peptide－N－asparigineamidase F，PNGase F）酶切等方法，分析4－32－STT3D表达的抗人表皮生长因子受体2（HER2）抗体（anti－human epidermal growth factor receptor 2）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte－macrophage colony－stimulating factor，GM－CSF）N－糖基化程度，并测定STT3D转入和诱导表达对酵母生长情况的影响。结果 SDS－PAGE结果显示，4－32－HL菌表达的抗HER2抗体除有一条相对分子质量约55×103的重链主带外，还有一条约50×103的未糖基化条带。4－32－HL－STT3D菌表达为均一的55×103条带，无50×103条带。 PNGase F酶切后，上述重链呈50×103的均一条带。 Western印迹证明以上所有条带均为抗体成分。以GM－CSF作为报告蛋白验证STT3D的作用，结果显示，4－32－GM－CSF菌表达的GM－CSF为22×103和20×103的两条带，而4－32－GM－CSF－STT3D表达则为均一的22×103条带。 PNGase F酶切4－32－GM－CSF和4－32－GM－CSF－STT3D菌表达的GM－CSF后，GM－CSF呈18×103的均一条带。分别测定STT3D外源基因转入和诱导表达时对酵母生长情况的影响，统计学分析显示，STT3D转入不诱导对酵母生长影响不显著，STT3D诱导表达对酵母生长影响极显著。结论过表达N－糖基转移酶的糖基工程酵母对靶标蛋白具有更高的N－糖基化修饰效率。
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Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用
目的：通过巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（ endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ，Endo-H），并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌（ Strepto-myces plicatus） Endo-H的cDNA序列，设计并合成Endo-H全基因，将其克隆至P．pastoris表达载体pPIC9中，重组质粒转化P．pastoris JC308宿主菌，工程菌经甲醇诱导，分泌表达Endo-H，目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后，纯度可＞95％。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳（ DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis，DSA-FACE）分析核糖核酸酶B（ribonuclease B，RNaseB）的糖基结构，比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F（peptide-N-asparigine amidase F，PNGase F）的糖基切割功能。结果利用P．pastoris表达制备Endo-H，可切割天然或变性状态下的β-1，4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链，不能切割复杂型糖链糖蛋白；经DSA-FACE分析，结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc，PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2，两者相差一个GlcNAc。结论通过P．pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性，可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。
关键词： 内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H 毕赤酵母 N-糖基化 -
不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析
目的 建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异.方法 用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析.以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较.结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A.结论 成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础.
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基于超滤反应器的蛋白质N-糖基化快速分析方法
随着生物科技的发展,蛋白质药物正越来越多地被应用在疾病诊疗的各个方面.但是蛋白质的匀质性,特别是蛋白质N-糖基化修饰成为限制蛋白质药物发展的瓶颈,因此蛋白质N-糖基化修饰的分析方法正逐渐成为蛋白质药物研发的关键技术.为了提高蛋白质N-糖基化修饰分析效率,本文建立了基于超滤反应器的N-糖分离纯化方法.新处理方法大幅提高了含N-乙酰基葡萄糖N-糖的提取效率(10％～20％),避免了唾液酸结构的降解(20％～100％),同时将处理时间缩短至30 min.通过与HPLC-HRMS分析方法联用,提高了样品分析效率.本文建立了高效、可靠,适合蛋白质药物的N-糖基化修饰分析方法.
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毕赤酵母N-糖基化改造的研究进展
毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白.由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用.在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N-糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢.近期,毕赤酵母N-糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路.现对毕赤酵母N-糖基化的研究进展进行简述.
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N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响
目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响.方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7.用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达.采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肤特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量.结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外.ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P＞0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P＜0.05).结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能.HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的.
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人感染高致病性H5N6禽流感病毒的分子生物学特征
目的 分析2014-2015年3例新型人感染高致病性禽流感(HPAI) H5 N6毒株的血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)基因序列,探讨该病毒的遗传变异及分子生物学特征.方法 收集GenBank、全球共享禽流感数据倡议组织(GISAID)及浙江大学传染病诊治国家重点实验室提供的H5N6病毒基因序列,利用生物信息软件MEGA6.0及NetNglyc服务器对基因序列进行遗传进化和分子变异特征分析.结果 3例感染HPAI-H5N6患者毒株的HA与NA氨基酸序列的同源性分别为96.5％ ～ 98.7％和90.1％ ～98.2％;HA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)和A/Sichuan/26221/2014(H5 N6)与A/duck/Eastern China/1111/2011(H5N2)同源性近,分别为97.7％和98.5％;A/Yunnan/0127/2015(H5N6)与A/muscovyduck/Vietnam/LBM631/2014(H5N1)同源性近(97.2％);NA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)和A/Yunnan/0127/2015(H5 N6)与A/swine/Guangdong/K6/2010(H6N6)同源性近,分别为97.2％和97.6％,A/Sichuan/26221/2014(H5N6)与A/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)同源性近(97.4％);进化树分析显示3例患者毒株处于2个不同的分支;HA基因包含有S137A、T160A等突变,糖基化分析显示有6～7个N-糖基化位点.结论 新型人感染HPAI-H5N6病毒是一种重组病毒,其HA基因来源于亚洲禽类H5亚型,NA基因来源于亚洲禽类H6N6;HA基因位点突变及N-糖基化改变可能有助于增强对人类的感染.
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N-糖基化对KCNE1功能的影响
目的:探究N-糖基化在KCNE1功能中的作用.方法:根据N-糖基化序列特征"Asn-X-Ser/Thr"分析和N-糖基化特异消化酶实验检测KCNE1是否存在N-糖基化,通过点突变构建N-糖基化位点突变体并通过蛋白质印迹法检测其蛋白表达,细胞免疫荧光染色检测突变体亚细胞定位;免疫共沉淀检测突变体与KCNQ1的相互作用.结果:KCNE1存在N-糖基化,N5和N26是其可能位点;点突变获得KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q和KCNE1-N5,26Q 3个突变体.蛋白质印迹法确定N5和N26为KCNE1的两个糖基化位点;与野生型相比,突变体在细胞内呈现不同程度的蛋白囤积现象,KCNE1-N26Q表现尤为显著,KCNE1-N5,26Q和KCNE1-N5Q则表现略轻;KCNE1 N-糖基化突变体仍能与KCNQ1结合.结论:N-糖基化在KCNE1转运中发挥重要作用,其中N26较为关键;N-糖基化在KCNE1与KCNQ1之间的相互作用中不起重要作用.
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N-酰基葡糖胺衍生物对GABA转运体功能的影响
为筛选GAT蛋白活性抑制剂,以稳定表达GAT1蛋白的人胚胎肾细胞(HEK-293)为模型,利用GABA摄取定量测试测定N-酰基葡糖胺衍生物对该蛋白功能的影响.同时,由于GAT1蛋白的功能与其N-糖链结构尤其是末端唾液酸密切相关,再通过定量该蛋白糖链末端唾液酸的表达分析衍生物对蛋白糖链修饰的作用.结果显示,10 mmol/L 3-O-甲基-N-乙酰基葡糖胺(3-O-Met-GlcNAc)通过抑制GAT1蛋白的唾液酸化(降至66.8％)将GABA摄取活性减弱到到53％(P＜0.01);而10 mmol/L N-丙酰基葡糖胺(GlcNProp),N-环丙甲酰基葡糖胺(GlcNCyclo),N-己酰基葡糖胺(GlcNHex),N-乙酰氨基乙酰基葡糖(GlcNAc-acetamido)则通过抑制蛋白糖链末端修饰分别将GABA摄取活性减弱到54％、63％、63％和67％(P＜0.01).因此,N-酰基葡糖胺衍生物可用于进一步筛选研究GAT蛋白活性抑制剂或唾液酸生物合成抑制剂.
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N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究
目的 构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性.方法 借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的 蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGase F分析IL-24糖基化形式和程度.MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性.结果 成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1.约70%的IL-24发生了N-糖基化.重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响.N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24.结论 毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的 蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础.
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酵母杀手毒素的作用机制及应用研究进展
杀手毒素的作用机制与抑制酵母细胞壁β-葡聚糖合成有关.甘露糖蛋白可能是HM-1的受体之一,其抗性的产生是N-糖基化减少所致.HM-1是88个氨基酸组成的亲水蛋白质,C-末端82和86位精氨酸对其杀手活性至关重要.杀手毒素的研究对开发新型抗真菌及食品贮存剂极为有用.
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抑制糖基转移酶GnT-V的表达可增强胶质瘤细胞放射敏感性
目的:探讨N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)介导的N-糖基化修饰在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用及调控机制.方法:采用RT-PCR和Western blot技术筛选GnT-V高表达的胶质瘤细胞;运用RNA干扰技术抑制GnT-V基因和蛋白表达,流式细胞术和荧光显微镜观察细胞N-糖基化修饰改变;4 Gy X-射线处理后分析细胞放射敏感性差异.结果:成功筛选GnT-V高表达的U251细胞;下调U251细胞中GnT-V的表达,可阻断N-糖链合成,逆转X-射线诱导的G2/M期阻滞,促进细胞凋亡.结论:抑制GnT-V的表达可通过阻断N-糖基化修饰增强胶质瘤细胞的放射敏感性.
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N-糖基化抑制反应诱导胶质瘤细胞的早期凋亡
目的研究N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长状态的影响.方法以依霉素(tunicamycin)为N-糖基化抑制剂,作用于人脑胶质瘤细胞株SWO-38,运用电镜技术及琼脂糖电泳,观察N-糖基化抑制对胶质瘤细胞生长的影响.结果依霉素作用于SWO-38细胞后,透射电镜下细胞出现线粒体等细胞器增殖,核仁消失,细胞固缩.琼脂糖电泳出现DNA梯形条带.结论N-糖基化抑制可以诱导胶质瘤细胞的早期凋亡.
