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神奇的流感病毒
那个圆球是一层脂质包膜,包裹着病毒的遗传物质.插在膜上的小棍,仔细看有两种:数目较多、看上去像柱子的是一种叫血凝素(简称HA)的蛋白质,数目较少、看上去像蘑菇的是另一种叫神经氨酸酶(简称NA)的蛋白质.
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唐山市甲型H1N1和H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因特征分析
目的 分析甲型H1N1和H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征及耐药相关位点突变.方法 随机选取2013-2016年唐山市分离的12株甲型H1N1和13株H3N2亚型流感病毒提取RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的片段并测序,采用MEGA 6.0软件构建NA基因核苷酸系统进化树,BioEdit v7.2.5软件比较核苷酸序列和氨基酸变异情况.结果 2013-2016年12株甲型H1N1和13株H3N2流感病毒NA基因核苷酸同源性分别为98.5％～100.0％和98.1％～100.0％.NA核苷酸进化分析表明,甲型H1N1和H3N2流感病毒分别属于6B和3C分支,其中2013-2014年6株甲型H1N1毒株位于6B分支,与疫苗株相比有9个氨基酸突变位点,2015-2016年6株H1N1毒株进化为不同亚支:2株6B.1亚支新增V13I、P93S和I314M位点突变,3株6B.2亚支新增L67I和T381I突变,1株6B分支新增I117M、I288V和S450G突变;2013-2014年、2014-2015年、2015-2016年H3N2毒株分别位于3C、3C.3a和3C.2a1亚支,与疫苗株A/Texas/50/2012 (3C.1)比较,3C.3a亚支病毒拥有V143M、E221D、P386S和I392T位点突变,与A/Switzerland/9715293/2013(3C.3a)比较,3C.2a1亚支病毒拥有S245N(增加一个糖基化NAT245-247)、S247T、T267K、P339N、I380V和P468H位点突变.奥司他韦和扎那米韦主要耐药基因位点未发现突变.结论 唐山市甲型H1N1和H3N2亚型流感病毒NA基因出现了新的基因进化分支.
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上海市长宁区2015—2016年冬春季甲型H1N1流感病毒基因特征分析
目的 对2015—2016年冬春季甲型H1N1流感病毒基因特征进行分析.方法 选取上海市长宁区流感网络实验室于2015—2016年流感冬春季流行高峰期分离的甲型H1N1毒株35株,采用RT-PCR扩增其血凝素基因(hemagglutinin,HA)及神经氨酸酶基因(neuraminidase,NA)全长,并对扩增产物进行序列测定.使用MEGA软件计算基因同源性,使用MegAlign软件分析相关抗原和耐药位点,使用NetNGlyc 1.0软件在线预测糖基化位点.结果 35株甲型H1N1流感病毒HA基因分布在Clade 6B.1、6B.2和6C分支上,以Clade 6B.1为主.与2015—2016、2016—2017年北半球推荐的疫苗株A/California/07/2009的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.7％～99.0％和96.7％～98.2％.与2017—2018年疫苗株A/Michigan/45/2015的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.2％～99.3％和97.5％～99.5％;与疫苗株A/California/07/2009相比,35株分离株的HA都发生了抗原位点Sb区S185T位点和Cb区S203T位点突变,33株发生了Sa区K163Q位点突变,7株发生了Cb区Q223R位点突变.受体结合位点和糖基化位点的氨基酸序列均未发生变异.对35株病毒NA基因上9个与耐药有关的基因位点进行分析,1株发生了H274Y位点的改变.结论 2015—2016年冬春季流行的甲型H1N1病毒的HA和NA基因序列改变可能是造成流行高峰的主要原因.
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2014—2016年四川省B型流感病毒全基因组进化特征分析
目的 了解2014—2016年四川省B型流感病毒的流行特点,明确流行株与国际疫苗株的匹配情况及流感病毒全基因组进化特征.方法 选取2014—2016年四川省分离的29株B型流感病毒,全基因组测序后完成序列拼接,采用Bioedit、MEGA5.0软件对各基因片段进行系统发育分析及分子特征分析. 结果 2014—2015年以Yamagata系流感病毒为主,2016年以Victoria系流感病毒为主.全基因组分析表明,29株B型流感毒株中有5株发生了B/Yamagata系血凝素(hemagglutinin,HA)和B/Victoria系神经氨酸酶(neuraminidase,NA)间的重配;B/Yamagata系HA氨基酸序列与国际疫苗株B/Massachusetts/2/2012相比,进化树上group I分支毒株突变较多,所分析的15株病毒株均发生K58R、A118P、N126K、S160I、N176Y等14处氨基酸突变;2016年的11株Victoria系毒株与毒株B/Brisbane/60/2008相比,HA基因主要有2个氨基酸位点发生了共有突变(I127V、N139D).本研究中的29株分离株均未发生NA蛋白酶活性位点及耐药位点的突变.结论 2014—2016年四川省B型流感病毒两系交替流行,29株分离株中的5株出现BY/BV系间神经氨酸酶基因的重配,会导致抗原转变使疫苗失去保护效果,双组分的B型流感疫苗可能更为有效;NA重要的氨基酸位点相对保守.
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四川省1996～1999年流感监测结果分析
由于流感病毒特别是甲型流感病毒的抗原(主要是血凝素和神经氨酸酶)不断发生变异,使得人体因曾经感染而获得的免疫力很快失效,一旦有新亚型出现,很容易在人群中造成流行甚至大流行.
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2003-2014年浙江省宁波市乙型流行性感冒病毒血凝素和神经氨酸酶基因变化特征分析
目的 分析2003-2014年宁波市乙型流行性感冒(流感)病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子流行病学特征.方法 采集宁波市2003-2014年哨点监测医院的流感样病例标本进行流感病毒分离鉴定,选取不同时期的乙型流感毒株进行HA和NA基因序列测定,采用生物信息学软件分析变异和进化.结果 宁波市乙型流感病毒Victoria和Yamagata两大普系流行株的HA及NA基因在2003 2014年间每年均有不同程度的氨基酸序列变异,其中明显的为2005年与2009年的Victoria系毒株及2007年与2010年的Yamagata毒株变异.每当HA基因序列发生明显变异时NA基因也同时出现明显的变异,而且有时NA基因的变异比HA基因更明显.同时发现2013 2014年流行的乙型流感病毒为Yamagata系HA与Victoria系NA的重配株.结论 乙型流感两大谱系流行株的HA基因发生变异时NA基因也会出现变异,甚至较HA基因更快.2013-2014年宁波市乙型流感高发的流行株为Yamagata系HA与Victoria系NA基因的重配株.
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浙江省近年甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析
目的 分析浙江省2009-2013年初甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)序列进化特征.方法 提取浙江省2009-2013年初29株甲型H1N1流感病毒基因组RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NA基因,测序并拼接出ORF.以浙江省不同年份与地域15份代表性毒株NA序列和GenBank数据库中选取的22株2009-2012年国内外甲型H1N1流感病毒NA基因序列,采用MEGA 5.1软件对其进行序列比对并构建种系发生树.结果 扩增并测序获得29株甲型H1N1流感病毒的NA基因ORF的全长序列,与国内外甲型H1N1流感病毒NA序列比对后显示序列的同源性较高,浙江省毒株与北美早期甲型H1N1流感病毒典型代表株A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.20％ ～99.50％,其中采集于2012年末和2013年初的4份病毒NA与A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.63％ ～99.14％.在1株采集于2010年1月的甲型H1N1流感病毒NA的基因序列中发现可导致奥司他韦耐药的H275Y突变基因型.结论 虽然浙江省后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,但所有毒株之间基因同源性仍然较高,所有毒株的神经氨酸酶基因同源性达到98.20％及以上,序列分析结果证实1份毒株携带奥司他韦耐药基因型突变.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 神经氨酸酶 序列分析 种系发生树 -
2009-2012年浙江省湖州市甲3亚型流行株基因特性分析
目的 分析2009-2012年湖州市甲3亚型流感病毒主要抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子变异特征.方法 选择浙江省湖州市2009-2012年流感流行期间分离的甲3亚型代表株11株,提取病毒RNA,扩增HA1和NA基因,进行序列测定,用MegAlign软件分析处理.结果 湖州市近几年甲3亚型流感流行株在HA1区的核苷酸长度均为987 bp,编码329个氨基酸；在NA区的核苷酸长度为1362 bp,编码454个氨基酸.2009-2012年甲3亚型流感病毒分离株HA1区与NA区的氨基酸同源性分别在94.7％～99.9％与96.2％～ 100.0％之间,HA1区的变异较NA区更大.4个流感流行期分离的甲3亚型流感毒株相比HA和NA发生了多个氨基酸位点的替换.此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异.结论 2009-2012年湖州市甲3亚型流感病毒流行株发生明显变异,基因重配和抗原漂移是病毒发生变异的主要机制.
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2010-2012年长沙市流感流行情况及B型流感病毒基因特性分析
目的 分析2010-2012年长沙市流感流行情况,并探讨B型流感病毒分离株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的分子流行病学特征.方法 采集长沙市流感网络监测哨点医院及暴发点流感样病例(ILI)咽拭子样本,狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离,血凝和血凝抑制实验进行型别和亚型鉴定；提取B型流感病毒核酸,一步法RT-PCR扩增HA和NA基因片段,双向测定扩增产物核苷酸序列,对基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 2010-2012年间,长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,流行高峰为冬春季.3年间共分离到B型流感病毒78株,其中79.5％为Victoria系,20.5％为Yamagata系,以Victoria系为主.与WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,HA基因的同源性在87.2％～98.4％之间,NA基因的同源性在94.5％～97.5％之间.氨基酸序列分析发现,与疫苗株相比,HA蛋白主要存在单个氨基酸的突变；种系进化分析发现,所有毒株HA和NA蛋白位于相应的谱系内,无抗原重排发生.结论 2010-2012年间长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,B型流感病毒HA基因出现抗原漂移,但无重组毒株的出现.
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2009-2011年杭州地区甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因的遗传进化分析
目的 了解2009年7月以来杭州地区甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)的变异情况,分析其遗传进化特征.方法 在流行季节采集发热病人咽拭子样本,经病毒分离培养及亚型鉴定后,用特异性引物扩增NA基因,测序并分析其遗传进化特征.结果 2009年7月至201 1年3月,共检测监测样本1 898份,流感病毒阳性率为37.9%.期间经历了两次甲型H1N1流感病毒流行高峰.各时间段分离株间NA基因高度同源,序列相似性97.9%～100%,但2010/2011年流行株在进化树上分为两支,且与2009/2010年流行株遗传距离相对较远.进一步分析后发现,虽然耐药位点、酶活性位点及其附近氨基酸相对保守,但多个氨基酸变异发生于抗原决定簇上,且增加了NA蛋白茎部第42位糖基化位点.结论 结果预示着酶抑制剂类药物对预防和治疗甲型H1N1流感病毒仍将有效,但在开发新疫苗时应该尽可能的避开已经发生漂变的抗原决定簇.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 神经氨酸酶 遗传进化 突变 -
浙江省1999-2010年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因变化特征分析
目的 分析1999-2010年浙江省乙型流感病毒主要抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子变异特征.方法 采集浙江省流感暴发疫情和哨点监测医院的流感样患者呼吸道标本,荧光定量RT-PCR快速检测和病毒分离,选取乙型流感病毒分离代表株进行HA和NA基因测序,采用生物信息学软件分析变异和进化.结果 共分析浙江省乙型流感病毒分离株34株,其中Victoria系20株,Yamagata系14株;1999-2010年间Victoria系毒株的HA1基因变异率4.5%,Yamagata系毒株为3.4%;2004年后分离的Victoria系毒株均为基因重配株,HA属于Victoria 系,而NA属于Yamagata系;2010年新型甲型HINI流感流行高峰过后,浙江省仍以乙型流感病毒流行为主,分离株与2009-2010年流感疫苗株B/Brisbane/60/2008接近,与往年乙型流感毒株相比HA和NA发生多个氨基酸位点变异.结论 1999-2010年浙江省乙型流感病毒流行株发生明显变异,基因重配和抗原漂移是病毒发生变异的主要机制.
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流行性感冒疫苗组分的确定及其免疫预防策略
流行性感冒(流感)病毒主要由内、外抗原两大部分组成,因外抗原中的血凝素和神经氨酸酶在不断变化,导致每年新亚型不断产生,其中流感病毒甲型变异频繁,尤其是甲1和甲3型易造成大流行,10～40年发生1次;乙型变异比较少,不会形成大流行;丙型没有变异.目前使用的流感疫苗一般包括3个型别即甲1、甲3和乙型流感病毒株.
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2010-2012年宁波市乙型流行性感冒病毒血凝素及神经氨酸酶基因差异分析
目的 分析2010-2012年宁波市乙型流行性感冒(简称流感)病毒的流行状态及表面抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)进化情况.方法 收集宁波市2010-2012年流感样患者的咽拭子和含漱液标本3440份,进行流感病毒分离鉴定;同时采集2010年正常人群血清628份,进行抗体滴度测定.选择不同时期乙型流感分离株进行HA和NA基因序列测定,分析病毒表面抗原基因的进化方向与流行规律的关系.结果 共计109份临床样本分离出乙型流感病毒,其中Victoria系102份(93.6％),Yamagata系7份(6.4％);在628份正常人群血清中,Victoria和Yamagata系乙型流感病毒抗体阳性率分别为321 (51.1％)和300 (47.8％),差异无统计学意义(x2=1.405,P＞0.05).进化分析显示,2010-2012年Victoria系HA基因均聚集在疫苗株Malaysia/2506/2004分支中,而NA基因则出现了不同方向的进化分支.Victoria系流行株与Brisbane/60/2008在HA基因中仅1～5个氨基酸位点的差异,而NA基因上有6～16个位点的差异.相比HA基因,Victoria系NA的进化速度更快.结论 2010-2012年宁波市Victoria系乙型流感的NA基因进化速度比HA基因快;综合HA与NA基因序列分析对观察流感病毒的基因变异更为灵敏可靠.
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2014-2015年云南省边境H5N6禽流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因序列分析
禽流感是由A型流感病毒引起的一种急性传染病[1-3]。病毒基因组由8个分节段的单股负链RNA组成，其中血凝素和神经氨酸酶均为糖蛋白，是作为A型流感病毒亚型划分的依据。禽流感病毒根据血凝素和神经氨酸酶的抗原性差异分为H1~H16、N1~N9不同亚型[4-5]；根据其致病性和传播能力强弱可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类，高致病性主要是由H5和H7亚型流感病毒引起的[6-7]。近年来H5N6成为全球高致病性禽流感分布流行的主要亚型，开展云南省禽流感病毒H5N6病原监测、血凝素和神经氨酸酶基因变异和进化分析，对禽流感研究及防范新基因型入侵具有重要意义[8]。
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流行性感冒病毒耐药性监测研究进展
流行性感冒病毒简称流感病毒,分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型.临床上用于抗流感病毒的药物主要有两类,一类是烷胺类药物,即M2离子通道抑制剂,包括金刚烷胺和金刚乙胺,该类药物仅作用于A型流感病毒,对B型流感病毒无效;另一类是神经氨酸酶( neuraminidase,NA)抑制剂,包括奥司他韦(oseltamivir,达菲)、扎那米韦(zanamivir,依乐韦)、帕拉米韦( peramivir)、拉尼那米韦(laninamivir),其中后2种目前仅在日本和(或)韩国上市.评价流感病毒药物敏感性的方法包括表型分析和基因型分析.常用化学发光或荧光底物法进行表型耐药分析,而基因型分析则是通过常规测序或焦磷酸测序等方法测定抗性突变的分子标记[1].
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2011-2012年中国甲型H3N2亚型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂药物的敏感性
目的 分析2011-2012年中国甲型H3N2亚型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂药物(NAI)的敏感性.方法 所有待检流感毒株来自中国流感监测网络,该网络覆盖中国31个省份的408家网络实验室和554家哨点医院.本研究挑选了2011年1月1日至2012年12月31日采样分离的毒株,共1 903株,其中经国家流感中心复核鉴定为甲型H3N2亚型流感病毒的毒株共721株,采用化学发光法检测其对奥司他韦和扎那米韦的敏感性.药物敏感参考毒株为A/Washington/01/2007(119E),奥司他韦耐药参考毒株为A/Texas/12/2007(E 119V).采用t检验比较不同年份毒株对NAI敏感性的差异.结果 A/Washington/01/2007对奥司他韦和扎那米韦的半数抑制浓度(IC50)值分别为(0.10±0.02)、(0.30±0.05) nmol/L,A/Texas/12/2007对奥司他韦和扎那米韦的IC50值分别为(4.27±1.60)、(0.20±0.03) nmol/L.721株甲型H3N2亚型流感病毒中,2011年132株,2012年589株.2011和2012年的甲型H3N2亚型毒株对奥司他韦的IC50值范围分别为0.04～0.62、0.02～0.95 nmol/L,均在A/Washington/01/2007的IC50值10倍(1.00 nmol/L)以内.2011和2012年的甲型H3N2亚型毒株对扎那米韦的IC50值范围分别为0.12～0.80、0.04～0.72 nmol/L,均在A/Washington/01/2007的IC50值10倍(3.00 nmol/L)以内.结论 2011-2012年检测的中国甲型H3N2亚型流感毒株均对奥司他韦和扎那米韦敏感.
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七味清咽喷雾剂防治流感的药理作用
目的:观察七味清咽喷雾剂对H1N1流感病毒的防治作用及与达菲联合应用的效果.方法:体外试验采用组织细胞培养法,观察不同浓度药物对流感病毒FM1病毒株致细胞病变(CPE)的作用;体内试验采用甲型H1N1流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠造成肺炎模型,观察药物的疗效;达菲与七味清咽喷雾剂(剂量均降低50%)联合应用,观察中药的增效减毒作用.结果:①七味清咽喷雾剂对Hela和Hep-2细胞的大无毒浓度(TC0)为0.192 g·L-1,该浓度有一定缓解流感病毒的致细胞病变作用,但作用较弱;②七味清咽喷雾剂高剂量经7 d连续给药,可明显降低H1N1流感病毒感染肺炎模型小鼠血清中TNF-α含量,提高IL-2水平;③七味清咽喷雾剂中剂量与达菲(较单独应用剂量降低50%)联合应用可降低感染小鼠肺脏指数,肺脏组织病变程度明显减轻;④二者联合应用降低感染动物血中神经氨酸酶(NA)活性的作用强于单用达菲组.结论:七味清咽喷雾剂通过影响小鼠免疫功能,改善流感病毒引起的小鼠肺炎症状,降低H1N1感染小鼠的肺指数;与达菲联合应用具有增效减毒作用.
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传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选
目的:运用计算机虚拟筛选技术从传统中药数据库(TCM database@Taiwan)中快速搜索H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的中药小分子抑制剂.方法:采用AutoDock Vina软件对蛋白质晶体结构数据库PDB中NA与小分子抑制剂扎那米韦形成的复合物(PDB代码为4MWX)三维结构活性部位进行分析,基于传统中药配体库进行分子对接初次筛选.综合运用传统中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP及Accelrys公司开发的Discovery Studio 2.5分子模拟软件包内TOPKAT模块计算药代动力学参数和毒性预测对分子对接结果进行2次筛选.结果:以原配体(扎那米韦)的自由结合能为阈值,筛选出中国传统中药数据库中3个类药性良好的化学成分与NA亲和力高于上市的抗流感药物扎那米韦的天然小分子化合物,并且确定了它们的中草药来源.结论:该研究结果可促进从传统中药库中提取、设计及实验合成新抗H7N9流感病毒药物.
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96种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性的影响
目的:筛选抑制流感病毒神经氨酸酶的中药材,为临床流感治疗提供参考.方法:以2-(4-methylumbellifery1)-α-D-N-aeetylneuraminie acid(MUNANA)为底物,分别用奥司他韦、各种中药材进行干预,体外观察药物对流感病毒神经氨酸酶的活性影响.结果:在96种中药材中,有25种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性有促进作用,有71种中药材对流感病毒神经氨酸酶活性有抑制作用,其中抑制率在50％以上中药材有19种,特别是五倍子、苏叶、柴胡、白蔹、石榴皮、槟榔、丁香7种中药材的抑制率在80.0％以上.结论:部分中药材对流感病毒神经氨酸酶活性抑制效应明显,它们可能在流感治疗中发挥重要作用.
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麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺部炎症与神经氨酸酶活性影响的研究
目的:进一步探讨麻杏石甘汤抗流感病毒的作用及机制.方法:①经鼻腔接种建立小鼠流感病毒肺炎模型.实验设空白对照组、模型对照组、奥司他韦组和麻杏石甘汤组,灌胃给药7d后,观检肺指数和肺组织病理变化.②以2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid为底物,检测麻杏石甘汤全方与拆方配伍组合对流感病毒神经氨酸酶活性的影响.结果:与空白对照组比较,模型对照组肺组织大量淋巴细胞浸润,肺指数明显增加(P＜0.01).与模型对照组比较,全方组肺组织病理变化得到改善,肺指数明显降低(P＜0.01).与模型对照组比较,全方组、麻黄组神经氨酸酶活性依次下降53.4％、75.4％；麻黄+杏仁、麻黄+石膏、麻黄+甘草、麻黄+杏仁+石膏、麻黄+石膏+甘草、麻黄+杏仁+甘草、麻黄+杏仁+石膏+甘草等7个含麻黄的配伍组合神经氨酸酶活性依次下降69.9％、75.5％、49.4％、67.1％、43.1％、46.7％、53.7％.杏仁+石膏,杏仁+甘草,石膏+甘草,杏仁+石膏+甘草等4个不含麻黄的配伍组合神经氨酸酶活性依次下降13.5％、2.6％、3.3％、-1.2％.结论:麻杏石甘汤能明显减轻流感病毒感染小鼠肺部炎症反应,降低肺指数,其机制可能与其抑制神经氨酸酶活性,阻止病毒增殖有关.麻黄在该方抗流感病毒作用中有重要地位.
