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长沙市家禽市场污水来源H9N2亚型禽流感病毒NS基因进化分析
目的 对长沙市家禽市场污水来源的H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨其传播风险.方法 从家禽市场收集1份H9N2 AIV样本(C09055049)进行NS基因PCR扩增和TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸比对和进化树构建.结果 序列分析表明,NS基因核苷酸序列全长890bp,分别编码NS1(217个氨基酸)和NS2(121个氨基酸)两个蛋白,进化树显示本研究中的NS基因属于A等位基因群的A/ Chicken/ Shanghai/F/1998-1ike,起源于国内早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94；NS基因与进化树不同分支代表株氨基酸比对显示,NS1与A/Chicken/Shanghai/F/98同源性高(96.3％),NS2与A/Chicken/ Beijing/1/1994和A/ Chicken/ Shanghai/ F/ 1998同源性高(96.7％).H9N2 AIV的NS1蛋白第92位D氨基酸,且NS1蛋白C-端缺失13个氨基酸,表现为低致病性的分子特征.结论 家禽市场污水来源的H9N2 AIV的NS1蛋白缺乏高致病性及感染人的分子特征,传播至人的风险较小.
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H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析
利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.
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鹌鹑源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及其生物学特性研究
本研究从人感染H7N9活禽交易市场的鹌鹑体内分离到1株H9N2亚型流感病毒并命名为A/Quail/Hangzhou/1/2013 (H9N2),并分析了该毒株的基因组特性及其对鸡的致病力.序列分析结果显示:基因组中HA、NS基因属于类CK/BJ/1/94分支,NA、NP、PA、PB1基因属于类SH/F/98分支,M和PB2属于类G1/97分支.关键氨基酸位点分析结果显示:HA的裂解位点为PSRSSR↓ GL,HA蛋白具有人样流感病毒受体结合位点Leu226,NA颈部出现63-65位氨基酸的缺失,M2蛋白Asn31和NS1蛋白Ser42、Ala149发生了突变.该毒株的IVPI为0.36.雏鸡感染性试验的结果显示:所有接种鸡在感染后的第3天从呼吸道和消化道都可检测到排毒,直至第11天停止排毒.同居感染动物于放入后的第2天达到排毒高峰,排毒率为100％,持续至第8天停止排毒.感染动物的病毒再分离结果显示:肺和气管的带毒时间可达5天,其他组织为3天.以上结果表明:该毒株是一株H9N2大陆流行谱系的低致病性禽流感病毒.本研究为H9N2亚型禽流感病毒的预防和监控提供了一定的理论依据.
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用8质粒病毒拯救系统产生H9N2/WSN重组A型流行性感冒病毒
把禽流行性感冒(流感)病毒A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因cDNA克隆至polⅠ-polⅡ双向转录和表达载体pHW2000,用这两种质粒与8质粒病毒拯救系统中流感病毒A/WSN/33(H1N1)6个内部基因eDNA的质粒组合(6+2重排),共转染COS-1细胞,产生了能在鸡胚中高滴度增殖的H9N2/WSN重组病毒.用A/WSN/33的8个基因cDNA质粒作对照,也产生了转染子病毒.经过EID50测定和MDCK 感染实验,新基因型H9N2/WSN病毒感染鸡胚的能力强(EID50为10-11/0.2ml),而且对鸡胚的毒力弱,在不加胰酶的情况下不使MDCK细胞产生病变.经电镜观察,两个转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似.反向遗传操作技术的建立,为对禽流感病毒基因功能和疫苗构建等方面的研究提供了新的手段.
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H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的全基因克隆及序列分析
本研究以一株2006年广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/HL/2006(H9N2)(简称Ck/GD/HL/06)为研究对象,用RT-PCR法扩增病毒基因组各片段(包括5'端和3'端的非编码区序列),将扩增片段进行克隆、测序并与参考毒株的相应序列进行比较分析,绘制各基因片段的系统发生树.分析结果表明,Ck/GD/HL/06株的HA基因同1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)在同一进化分支,从HA的糖基化位点、受体结合位点等综合分析,该毒株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9亚型禽流感病毒的特点.HA的226位氨基酸残基为亮氨酸(Leu),具有同哺乳动物SAα,2-6受体结合的特性.Ck/GD/HL/06的PB1、PA和NP基因.同2004年越南分离的人源高致病性H5N1亚型流感病毒A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)株(简写A/VN/1203/04)的核苷酸序列一致性分别是93.8%、95%和96.8%,在先前的研究中未见有类似特性毒株的报道,而这种特性H9N2亚型AIV的出现,是否会增加在重组过程中产生新的高致病性H5N1亚型AIV的可能性,是值得我们关注的一个问题,也提醒在我国华南地区应更加重视防控H9N2亚型AIV,做好长期对H9N2亚型AIV监控及分子流行病学调查的工作.
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禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制
禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁.本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性.结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织；免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nuc1eoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞；免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染Ⅱ型肺泡细胞.结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能.
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禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)HA基因的克隆及序列分析
禽流感是由A型流感病毒引起的禽的一种疾病综合症.1878年首次在意大利爆发流行,当时称该病为"鸡瘟".之后,许多国家和地区都有该病的报道,包括美国、英国、澳大利亚、爱尔兰、比利时、荷兰、法国、俄罗斯、加拿大、以色列、匈牙利、日本、中国(包括香港)等[1-3].
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山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析
为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析.结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓ GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征；有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守；234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征；16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3％～99.9％和97.1％～99.6％；16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群.
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用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒
对患儿咽拭子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感(H9N2)感染.咽拭子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体,H1滴度160,母亲H9N2抗体1:20.可确定广州市有H9N2感染,并提示H9N2可通过人传播人而感染.
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深圳地区人和鸡群中H9N2亚型流感病毒病原学和血清流行病学调查
目的了解甲型流感病毒H9N2亚型毒株在深圳地区鸡群和人群中的分布.方法采用常规的鸡胚双腔法来分离病毒.抗体测定,采用红细胞凝集抑制(HI)试验和中和试验测定法.结果从深圳地区农贸市场鸡群中分离到27株H9N2亚型流感病毒,但未能从人群中分离到H9N2病毒.约有26%人血清中检测到H9亚型毒株的抗体,(HI滴度≥20),同时还发现抗体阳性率和几何均数随人群年龄增长而增高,同时与职业有关.然而,在鸡群中H9毒株的抗体阳性率仅为7%.结论禽H9N2毒株不仅能感染人,而且在深圳地区人群和禽类中较为广泛的分布.人H9N2很大可能来源于鸡的H9N2毒株.
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猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用
目的了解猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用.方法用RT-PCR扩增目的基因,用PGEM-T Vector(美国Promega公司)4℃过夜连接,重组质粒转入dH5 α细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序,然后进行进化树分析.结果两株山东猪H9N2毒株基因组与人及禽分离出的H9N2病毒均有差异,中国内地从人分离出的H9N2毒株的基因组接近鸡的毒株,而香港特区从人分离出的接近鹌鹑的毒株;禽H9N2毒株不仅宿主范围广,同时其基因组具有多样性.结论禽H9N2亚型毒株是直接感染人,而不是通过所谓的中间宿主猪,然后再感染人.
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从人分离出两株甲型流感H9N2亚型毒株内部基因特性的研究
目的了解2株从人分离出的H9N2亚型毒株内部基因特性,并弄清其来源.方法用R-PCR扩增目的基因,用PGEM-T Vector(美国Promega公司),4℃过夜连接,重组质粒转入dH5α细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序.然后进行进化树分析.结果2株测定毒株内部基因均为G9基因系,它们相互间除PA基因有差异外,其余5个基因均相同.结论2株测定毒株的基因组均为G9基因系,它们是由携带不同基因特性H9N2毒株的禽群分别直接感染人,而不是来自同一禽的H9N2亚型流感病毒.
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H9N2亚型禽流感病毒血凝素抗体乳胶凝集检测方法的建立
禽流感病毒(avian influenza vires,AIV)是一种RNA病毒,属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)A型流感病毒属.A型流感病毒根据其表面血凝索(hemagglutinin,HA)与神经胺酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的不同可分为若干亚型,目前已发现的A型流感病毒的血凝素有16个亚型(H1～16),神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)[1].1997年中国香港暴发H5N1亚型高致病性禽流感,导致18人感染,6人死亡,这引起了人们的疑虑:H9N2亚型禽流感病毒能否跨越种间障碍从而导致人群的感染?1998-1999年,广东省以及香港地区暴发了H9N2亚型禽流感,直接导致多人感染[2-3].2003年11月,香港地区又发生了H9N2亚型禽流感病毒感染人的事件[4].
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甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究
目的了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法病毒在鸡胚中传代，从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA，通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增，接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后，RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。后用MegAlign（1.03版）和Editseq（3.69版）软件进行种系发生学分析。结果从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R-S-S-R，除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含7个潜在的糖基化位点外,而其余的均含8个。6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有2-16个不同，这些不同分布在24个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性大来自鸡的H9N2毒株，而不是来源于鸽的H9N2毒株。但，H9N2毒株是否具有人传人能力，至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。
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H9N2禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶DNA疫苗对小鼠的免疫保护研究
目的 检测H9N2禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)DNA疫苗保护小鼠抵抗致死量同源病毒感染的能力.方法 通过小鼠肺对肺传代,建立禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)小鼠适应株.同时,构建病毒HA和NA DNA疫苗,以不同剂量电击法免疫小鼠1或2次,在初次免疫后4周或加强免疫后1周用致死量(40 LD50)鼠适应型病毒攻击小鼠.通过测定小鼠血清抗体滴度、小鼠存活率和肺部病毒滴度来评价疫占的效果.结果 HA或NADNA 10μg免疫1次或3μg免疫2次均可保护小鼠抵抗致死昔H9N2病毒的感染.结论 低剂量HA或NA DNA可为抗H9N2禽流感病毒感染提供有效的免疫保护.
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甲型H5N1和甲型H9N2流感病毒的抗原性和遗传学特征以及可能用于人类疫苗的候选疫苗病毒的研制
此文概述了2010年2月17日-9月26日甲型H5N1和甲型H9N2流感疫情、甲型H5N1流感病毒的抗原性和遗传学特征以及可用于人类疫苗的病毒研制状况.
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H9N2亚型流感病毒的生物学特性及其潜在危险
H9N2亚型流感病毒是低致病性流感病毒，严重影响养殖业的发展，并且具有感染哺乳动物的能力，威胁人类健康；能够与其他流感病毒重组，产生新型流感病毒，有造成流感大暴发的潜在风险。本文列举了H9N2亚型流感病毒的生物学特性，总结近年来H9N2的流行情况，致病性改变和其作为新型流感病毒的基因供体等几个方面的研究，阐述H9N2亚型流感病毒的潜在危险性。
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一株人感染H9N2禽流感病毒高通量测序及序列分析
目的 对一株人感染H9N2禽流感病毒进行高通量测序(next-generation sequencing,NGS)分析,探讨其在人群流行的可能性.方法 应用高通量测序技术进行全基因组序列测定(whole genome sequencing,WGS).对8个基因进行相似性检索,构建系统进化树并分析其关键位点的分子特征.结果 8个基因与GenBank基因库相似度高序列的来源不完全一致,系统进化树显示HA基因属于欧亚系Ⅰ群,M基因位于G1-like分支,PB2位于G9-like分支,NA位于一独立分支,PBI,PA,NP,NS均位于SH/F/98-like分支.HA基因裂解位点为PSRSSR/GLF,226位受体结合位点为L.除M2基因S31N突变之外,NA基因茎63～65位缺失,PA和PB2基因未发生L336M和Q591R,E627K等可以增强病毒对哺乳动物适应性的突变,但发现可以增强病毒毒力的突变如M1基因N30D和T215A,PB2基因L89V,NS1基因P42S.除M2基因S31N突变外,NA基因和M2基因的药物结合位点未发生E119G,R152K,H274Y,R292K和L26F,V27A,A30T,G34E等耐药性突变.HA和NA糖基化位点预测结果都有8个糖基化位点,其中分别有7个和5个可靠程度较高.结论 该H9N2禽流感病毒的大部分关键性位点较保守,只有少部分位点发生一定程度进化与变异,在人群引起流行的可能性不大,但需加强分子方面动态监测.
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H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Gansu/2/99株基因组的分子特征
目的 测定H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Gansu/2/99(CK/GS/2/99)分离株的基因组序列并与参考毒株进行同源性分析,阐明该毒株的遗传变异及分子特征.方法 采集发病鸡泄殖腔样品,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,采用RTPCR方法对CK/GS/2/99株的8个分节段基因进行扩增,分别将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与同源性分析.结果 CK/GS/2/99株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的开放阅读框分别由2280、2274、2151、1683、1497、1401、759、864个碱基组成,分别编码759、757、716、560、498、466、252/97、231/122个氨基酸残基.该毒株HA上HA1和HA2裂解位点序列为PARSSR ↓ GLF,具有典型的低致病性禽流感病毒的特征.同源性分析显示,CK/GS/2/99株与1998-2002年间大部分中国大陆分离株遗传关系较近,尤其与CK/NX/4/99和CK/HB/31/00株遗传关系密切.结论 CK/GS/2/99·与大部分流行于中国内陆的H9N2亚型毒株均来源于共同的祖先毒株CK/BJ/1/94,这为了解中国H9N2亚型禽流感病毒的分子流行病学提供了资料.
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3株H9N2亚型禽流感病毒广西分离株全基因组序列的测定与分析
目的 对3株H9N2亚型禽流感病毒进行全基因序列的测定与分析.方法根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的全基因序列,设计了8对引物,运用RT-PCR 方法获取了3株H9N2亚型AIV广西地方分离株A/Chicken/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/00的全基因序列,并对所得序列进行了比较分析.结果同源性分析及遗传进化分析发现,所分离的3个毒株的各基因与A/Chicken/Guangdong/4/00和A/Chicken/Jiangsu/1/00的相应基因的核苷酸序列有着较高的同源性和较近的亲缘关系,可能起源于同一种系.所分离毒株中每个毒株的8个基因,在遗传进化树上的分支不具有统一性,说明此3个毒株可能为不同基因亚系间发生自然重排的产物.氨基酸序列比较发现,A/Chicken/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/00 3株AIV的na基因核苷酸序列在开放性阅读框架的187～195位均缺失了ACAGAGATA共9个核苷酸,它们所编码的氨基酸为T、E、I.3个分离株的HA蛋白第226位氨基酸均为Gln,证明它们为人类非易感性的H9N2亚型AIV.结论此3株H9N2亚型流感病毒为基因自然重排的产物,其na基因均存在缺失,且从分子水平上证明它们对人类不具有易感性.
