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猪细小病毒PK-15细胞适应株的培育及增殖特性
为了研究猪细小病毒不同接毒方式的增殖规律及在不同细胞的病毒含量差异.本实验利用PK-15细胞对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)分离株进行适应性培养.针对PPV的NS1基因设计特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法.利用该方法检测PPV分离株同步和分步接毒的病毒含量,绘制一步生长曲线；同时检测PPV在HeLa、MDBK、PK-15、ST、F81、BHK-21和Marc-145细胞上的增殖特性.结果显示,PPV分离株盲传至12代产生CPE,继续传代培养10代仍能产生稳定的细胞病变,成功培育出PK-15细胞适应株.一步生长曲线显示,分步接毒的病毒含量高于同步接毒,而增殖周期短于同步接毒；PPV在不同细胞的增殖结果显示,各细胞开始出现CPE的时间依次为PK-15、ST、HeLa和MDBK,病毒含量高低依次是ST、PK 15、MDBK和HeLa,而不能在F81、BHK-21和Marc-145细胞上增殖.本实验首次利用荧光定量PCR方法成功分析PPV不同接毒方式的增殖规律及不同细胞的增殖特性,为PPV基础研究和疫苗生产提供资料.
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表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应
为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2.利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2.分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRVHB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免.一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒.结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用.结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株.
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猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立
以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPV NS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1.电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性.将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原佳包被浓度为1.9 μg/mL,血清佳稀释度为1:80,阳性判断标准定为OD待检血清＞0.4且OD待检血清/OD标准阴性值＞2.0.用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2％,与国外同类试剂盒的符合率为92.1％,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测.
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表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究
根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHI位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK-VP2.采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+株的基因组DNA与pUSK-VP2共转染PK-15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPV VP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP+2株,Southern blotting、SDS-PAGE、Western blotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验.结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中,并获得了表达.表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒.同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.
关键词： 伪狂犬病毒 猪细小病毒 VP2基因 TK-/gG-/VP+2株 -
猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究
利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1(+)分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒.将上述三种真核表达质粒分别转染IBRS-2细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在IBRS-2细胞表达,表达产物位于细胞中.在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用.
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生产用细胞基质中猪细小病毒污染检测方法的建立及应用
目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、低检出限等参数进行验证，并分析待测样品对试验的干扰。将PPV毒种感染ST细胞，制备病毒。以ST细胞为敏感细胞，建立PPV ST细胞感染性试验，并将ST细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合，建立ST细胞感染-PCR法，分析感染-PCR方法的灵敏度。利用所建立的方法进行生产用细胞样本的初步应用研究。结果 PPV荧光定量PCR法的特异性较好，与其他种属的细小病毒、猴SV40病毒及其他猪源病毒无明显的交叉反应，在109～104拷贝／μl范围内线性较好，R2达到0．98以上，灵敏度为1×104拷贝／μl，试验内和试验间的Ct的精密度均＜5％，试验内病毒定量拷贝数的精密度为5％～15％，试验间为30％～40％，低感染性病毒滴度检测限为1CCID50／ml。待测细胞样品成分对病毒检测无明显的干扰性。 ST细胞感染-PCR法的灵敏度为0．01CCID50／ml。利用荧光定量PCR法对22份细胞样品进行检测，结果均为阴性。结论成功建立了PPV荧光定量PCR检测法及ST细胞感染-PCR法，能够用于细胞中PPV的检测，有助于进一步提高生产用或治疗用细胞的安全性。
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猪细小病毒的致病机制与防控策略
猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是细小病毒科细小病毒属的成员,引起初孕母猪的繁殖障碍、仔猪的皮肤炎症和肠炎性腹泻.这些疾病在临床表现和病理特点上各不相同.近年来,PPV与其他病毒混合感染发生较多,是导致很多疾病综合征的病原之一.本文主要针对猪细小病毒的病原、致病机制和防控策略做一综述,以期对动物细小病毒病的防治提供的借鉴.
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猪细小病毒血清学检测方法的建立
目的 建立猪细小病毒血清学检测方法.方法 用抗猪细小病毒的猪源性血清,通过IFA和IEA两种方法,首先将阳性血清吸附PK-15细胞抗原,以排除非特异反应,通过对阳性血清及3种二抗(其中IFA以FITC标记的抗猪IgG抗体,IEA分别以HRP标记的抗猪IgG抗体和SPA-HRP作为二抗)进行浓度梯度滴定,确定佳工作浓度,并比较三种反应体系的敏感性.结果IFA高能检测出PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型中1个TCID50,而其它两种反应体系均只能检测100个TCID50.结论 间接免疫荧光检测方法比其它两种方法敏感性更高.
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猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备猪细小病毒(PPV)杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定.方法 按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞.用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定.结果 得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间.细胞上清效价均达1:1 ×10(4),腹水效价均达1:1×10(7),其亚型分别为IgG1,IgM,均为kappa链.2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒I型(PCV-1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、乙脑病毒(JEV)等均无交叉反应.IPMA和IFA检测结果 显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应.结论 成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性.
关键词： 猪细小病毒 单克隆抗体 免疫过氧化物酶单层试验 间接免疫荧光 -
心肌肽溶液纳米膜过滤法去除猪细小病毒研究
目的：研究纳米膜过滤去除猪细小病毒的可行性。方法：用Viresolve Prefilter和孔径20nm的Viresolve Pro纳米膜两级串联过滤，滤膜面积为3.1cm2，使用压力30psi。结果：三批加载猪细小病毒的心肌1肽溶液样品病毒降低量均≥3.44 logs.滤后样品经盲传三代实验后未出现细胞病变。结论：该方法可有效去除猪细小病毒。
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不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活猪细小病毒效果的影响
目的 研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响.方法 取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C3种配方(氯化钠浓度为C＜A＜B)缓冲液,经超滤透析制备人凝血因子Ⅷ半成品后,加入＞6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测.结果 在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02) LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)％.结论 已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性.
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猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
目的 建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证.用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果.结果 优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15 μl;反应条件:95 ℃ 3 min,95℃10s和60℃10s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5％.该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79％～2.81％,试验间CV为1.23％ ～2.21％,均＜5％,低检测限为102 copies/μl.辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果好,可使样品中的PPV滴度下降4Logs.结论 已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础.
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S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ制品中猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒灭活效果的验证
目的 验证S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品中猪伪狂犬病病毒(pesdorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活效果.方法 以PRV和PPV为指示病毒,模拟FⅧ生产工艺中的S/D及干热病毒灭活工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测3批FⅧ半成品的残留病毒滴度.结果 批号为201203002、2012-04003、201204004 3批FⅧ半成品经(25±1)℃S/D灭活处理15 min后,PRV滴度分别下降≥6.5、≥6.8、≥6.8 lgTCID50/0.1 ml;经(100±2)℃干热灭活30 min后,PPV滴度分别下降4.00、3.92、3.94 lgTCID50/0.1ml.结论 S/D法及干热法分别对FⅧ制品中PRV和PPV具有良好的灭活效果,本实验为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺的研究奠定了基础.
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猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用
目的 建立猪细小病毒(PPV)PCR检测方法.方法 设计一对针对PPV的特异引物,经方阵滴定法确定PCR检测的佳条件,以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行斑点杂交鉴定.提取已知滴度的病毒培养物DNA为模板,稀释后进行PCR扩增,测定PCR方法的敏感性.采用此方法检测了180份猪各种组织样品的DNA及PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型.结果 仅PPV野毒株和北京分离株AV7909能够扩增出一条531 bp的片段,测序结果证明为PPV的特异片段.该方法所能检测的小病毒滴度值为0.398 TCID50,可以检测出PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型中0.500 TCID50的感染量.180份组织样品均未检出PPV.结论 该方法具有良好的特异性和敏感性.
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运用套式PCR法检测胰蛋白酶中的猪细小病毒
猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为细小病毒科的一种自主复制病毒,它能持续感染哺乳动物细胞系,在持续感染期间细胞系照常生长,但在某些理化因素的刺激下,病毒会突然引起细胞病变,导致细胞死亡.这种持续感染对以细胞为材料的生物制品生产是十分危险的,它会带来意想不到的污染.因此,中国药典及WHO规程均要求生产用原材料胰蛋白酶必需经过PPV检测.PPV的检测方法很多,我们拟用一种简单、灵敏并且特异的方法来检测原材料胰蛋白酶.
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超滤法去除抗乙肝转移因子中病毒工艺的验证
目的对超滤法去除病毒工艺进行验证.方法以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用截留相对分子质量(Mr)为5 000的超滤膜在进压0.14 MPa、回流压0.07 MPa和进压0.2 MPa、回流压0.1 MPa条件下去除抗乙肝转移因子原液中病毒的效果,并以淋巴细胞提取液为供试品,在上述条件下超滤,用高效液相色谱法测定滤过液中各组分的Mr,以检查膜的完整性.结果PPV滴度为6.4 10logCID50/ml时,滤过液中未检测出PPV,经盲传三代,亦未发现特异性细胞病变;滤过液中各组分Mr均小于10 000,表明超滤膜完整.结论超滤法去除PPV是一种有效的方法.
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猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建
利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上.在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-S Tag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒.
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硒对猪细小病毒体外增殖抑制作用的研究
本文以PK-15细胞为模型,研究了亚硒酸钠、硒蛋氨酸和海藻硒多糖等三种硒化合物对猪细小病毒体外复制的抑制作用,以及还原型谷胱甘肽、D-甘露醇等氧自由基清除剂对不同来源硒的抑制病毒作用的影响.结果表明:三种硒化合物对猪细小病毒在PK-15中的复制呈现不同程度的抑制作用,在相同浓度时其强度依次为硒蛋氨酸、亚硒酸钠、海藻硒多糖,随着浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,呈剂量依赖性关系.还原型谷胱甘肽和甘露醇均有增强硒的抑制病毒复制作用,两者同时添加时,协同增强硒的抑制病毒复制作用.
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猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用
将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2 Ⅰ蛋白主要抗原域VP2 Ⅰ融合蛋白的高效表达.通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性.表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.结果表明:抗原的佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的佳稀释度为1:40,待检血清阳性标准初步定为OD490＞0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1.
关键词： 猪细小病毒 VP2蛋白的主要抗原域 原核表达 间接ELISA -
一氧化氮对猪细小病毒体外增殖的影响研究
本文研究了来源于不同前体物的一氧化氮(Nitro oxide,NO)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)体外增殖的影响.结果表明,NO前体物S-硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、L-精氨酸(L-Arg)均能够有效地诱导PK-15细胞产生NO,进而显著地抑制PPV在PK-15细胞上的复制,其效果与前体物的浓度呈正相关,在浓度为100μmol/L和200μmol/L时,SNAP产生NO的能力与抑制病毒复制的作用要强于L-Arg.在病毒感染前6 h和3 h添加SNAP或L-Arg对病毒复制的抑制作用比在病毒感染后3 h和6 h添加的作用强,表明NO的抗病毒作用主要发生在病毒感染的初始阶段.此外,添加具有抑制L-Arg产生NO作用的N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)能抵消L-Arg体外抗病毒的作用.
关键词： 一氧化氮 猪细小病毒 S-硝基-N-乙酰青霉胺 L-精氨酸 N-硝基-L-精氨酸
