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表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定
对CAV-2的E3区的Ssp Ⅰ片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAX△E3,然后将CPV VP2表达盒连接到pVAX△E3的E3区缺失处,构建了CPV VP2表达盒的转移载体p△ECPV-VP2,用Sal Ⅰ+Nru Ⅰ分别对pPoly2-CAV2和p△ECPV-VP2进行双酶切,分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,将含CPV VP2表达盒的Sal Ⅰ+NruⅠ片段定向克隆入pPoly2-CAV-2载体,获得了含CPV VP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2.用Asc Ⅰ+Cla Ⅰ对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切,释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组,将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除Sal Ⅰ+Nru Ⅰ片段的CAV-2基因组的两个片段混合,利用脂质体介导共转染DK细胞,出现病变,获得重组病毒CAV-2/CPV.并且,从形态学、基因组水平、目的基因的转录及重组病毒的生长特征等方面进行了鉴定.结果证明,CAV-2/CPV具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2/CPV在繁殖的过程中没有对CPV VP2表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录CPV VP2的mRNA.CAV-2/CPV的繁殖速度比野生型CAV-2的繁殖速度慢.
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犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析
为了分析中国部分省市犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律.查明中国目前CPV流行毒株现状,本项研究通过对2006～2008年武汉、南京和北京的宠物犬疑似犬细小病毒粪便样品进行检测,并对犬细小病毒PCR阳性产物进行RFLP分析,未发现宠物犬感染猫细小病毒的现象.从PCR检测犬细小病毒阳性标本15份以及广泛使用的犬细小病毒疫苗2株中克隆犬细小病毒VP2基因并进行序列分析,结果显示:检测到的15株犬细小病毒均属于CPV-2a亚型;与GenBank中的其他CPV-2a亚型相比,其中14株犬细小病毒存在独特的Ile324变异,并且国内主要使用的两个犬细小病毒疫苗株均属于CPV-2型,但是与CPV-2型原型毒株CPV-b相比,VP2蛋白氨基酸序列已经发生改变.通过构建基于犬细小病毒VP2蛋白氨基酸序列的系统发生树,发现在我国主要城市的宠物犬中流行的犬细小病毒CPV-2a亚型毒株单独构成一簇,并且与2008年的韩国分离株K001关系紧密,而与早期其他地区的犬细小病毒CPV-2a亚型流行株距离较远.这提示犬细小病毒流行株的变异具有某种时间和空间相关性.本研究对犬细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP2的编码蛋白进行遗传变异分析,为更好地预防和控制犬细小病毒提供基础.
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表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究
根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHI位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK-VP2.采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+株的基因组DNA与pUSK-VP2共转染PK-15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPV VP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP+2株,Southern blotting、SDS-PAGE、Western blotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验.结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中,并获得了表达.表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒.同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.
关键词： 伪狂犬病毒 猪细小病毒 VP2基因 TK-/gG-/VP+2株 -
表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病.IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属,其基因组由A和B两个节段组成.研究表明,IBDV主要的抗原性及致病性位点均位于A片段,其中VP2蛋白具有血清型特异性位点,并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体,是该病毒的主要抗原[1～2].
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究
利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV) VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性.通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jeat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至自来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性.同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力.结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用.本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助.
关键词： 中蜂囊状幼虫病毒(CSBV) VP2基因 系统进化 密码子优化 原核表达 -
中国国内首次检测到犬细小病毒CPV-2c
目的 分析犬细小病毒(CPV)流行毒株的分子生物学特征,研究犬细小病毒遗传进化规律,了解CPV流行毒株现状. 方法收集CPV阳性犬粪PCR扩增CPV-2c后进行RFLP分析,并进行病毒结构蛋白VP2基因的克隆、测序并进行序列分析. 结果经RFLP分析及序列测定,2份样品均为CPV-2c阳性.序列分析显示CPV-06/09及CPV-07/09 VP2序列与国外CPV-2c的基冈序列同源性在99%以上.进化分析表明CPV-06/09及CPV-07/09在进化树中形成一个独立的分支,不同国家的CPV-2c存在一定的差异. 结论通过RFLP分析及测序证实2份犬粪便样品为CPV-2c阳性,首次在我围检测到CPV-2c.系统进化树显示两分离株CPV-2c与国外CPV-2c有所差异,可能是传入我国的CPV-2c在向适应地区条件的方向进化,也可能是我国已有CPV变异.
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传染性法氏囊病病毒B87株 VP2基因克隆及序列分析
目的 获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)B87株VP2基因,并对其序列进行分析. 方法 采用RT-PCR方法扩增传染性法氏囊病病毒B87株VP2基因,扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆,测序结果与GenBank下载的21株参考毒株VP2基因编码区全核苷酸序列进行比较. 结果 克隆的VP2基因序列长度为1 536 bp.所测B87株与Ⅰ型参考毒株的核苷酸同源性介于95.1%～99.2%之间,与Ⅱ型毒株的同源性仅为54.1%～54.7%. 结论 大多数IBDV强毒株、变异株、超强毒株与B87株的亲缘关系较远;诱导产生保护性中和抗体的VP2抗原决定簇的两个亲水区氨基酸变异较大,是逃避B87疫苗株的免疫保护、导致免疫失败而发生免疫鸡群传染性法氏囊病(IBD)流行的分子基础.
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犬细小病毒新抗原变异株VP2基因的克隆与序列分析
目的 鉴定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)新抗原变异株的病毒型,为研究CPV变异及制备CPV特异性诊断和治疗试剂奠定基础.方法 从病毒细胞培养物中提取基因组DNA,设计合成针对VP2基因的1对特异引物,PCR扩增出VP2基因片段,克隆后测序,应用DNAstar进行序列分析.结果 得到CPV-VP-2基因序列15份,其中CPV-2a 10份,CPV-2b 5份;FPV-VP-2基因1份.结论 各序列与已发表的标准序列比较,同源性在98%以上,未形成明显分支.
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鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达
目的:为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征.方法:采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因,采用平端连接将其克隆到PUC119载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达.结果:发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基,同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒株的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别,其中3个是SJ1株特有的碱基变化.由基因序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别,同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别.原核表达的融合蛋白分子量为34Kd,占菌体蛋白含量的10.5%.结论:CAV的分子生物学的特性较稳定,变化不大.
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脑心肌炎病毒VP2基因真核表达质粒的构建
目的 构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)VP2基因真核表达质粒,并于CHO细胞中表达.方法 RT-PCR法扩增EMCV VP2目的基因,克隆至载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA3.1-VP2,脂质体法转染CHO细胞.转染48h后,RT-PCR法检测EMCV VP2基因mRNA的转录情况,免疫组化法及Western blot法检测EMCV VP2蛋白的表达情况.结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcDNA3.1-VP2构建正确.EMCV VP2基因mRNA及蛋白可在CHO细胞中正常转录及表达,且EMCV VP2蛋白可与兔抗EMCV阳性血清发生特异性结合,主要分布于CHO细胞膜上.结论 成功构建了重组质粒pcDNA3.1-VP2,并有效地在CHO细胞中进行了表达,为EMCV VP2基因体外表达及其功能的进一步研究奠定了基础.
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犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建
目的 构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒.方法 将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经Pac Ⅰ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50).电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平.结果 重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25 TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达.结论 已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒.
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犬细小病毒四川流行株分离鉴定及其遗传进化分析
从犬粪便中分离到1株细小病毒,在F81细胞出现明显的CPV病变,电镜观察可见细小病毒样粒子,进一步理化性质鉴定该病毒具有细小病毒的特征,表明所分离病毒为CPV,命名为CPV-04-08-CN-6.根据特异性引物,采用PCR技术扩增出VP2全长基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析.结果,CPV04-08-CN-6 VP2基因全长1755bp,编码584个氨基酸,与CPV参照株的VP2基因核苷酸同源性为99.69%,12个核苷酸发生错义突变,导致4个氨基酸发生变异.VP2基因的系统发生分析表明CPV-04/08/CN-6在细小病毒分类上属于CPV-2a型.
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传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究
本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有高免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况.SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变.21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性.
关键词： 鸡传染性法氏囊病超强毒 传代致弱 VP2基因 -
鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备
根据鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖.筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用Nco Ⅰ酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp2 5'端969bp片段的原核表达载体.经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体.薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%.包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体.Western blot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性.
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猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析
对猪细小病毒(PPV)SD-68株vp2基因进行的克隆和序列测定表明:SD-68株VP2基因全长1740bp,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPV SD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99%以上,氨基酸的同源性在96%以上.进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点.
关键词： 猪细小病毒SD-68株 VP2基因 进化树分析 组织嗜性 致病性 -
IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析
本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序.与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDVY3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99.0%以上,与其它一些超强毒株(very virulentIBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97.8%以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3.5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据.
关键词： 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因 高变区 超强毒株 -
传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较
对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.
关键词： 传染性法氏囊病病毒(IBDV) 致病性 VP2基因 高变区 -
犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析
从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒(CPV).提取病毒基因组DNA,并以此DNA为模板,采用人工合成的引物进行PCR 扩增,PCR产物经BamHI、SacI双酶切后,克隆于pUC19质粒的BamHI/Sac I位点.重组质粒pUCVP2经PCR鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明:获得了犬细小病毒内蒙株(CPV-IM)VP2基因的全长克隆, VP2基因全长1755nt,与国外报道的美国1株(CPV-N)、美国2株(CPV-B)和猫全白细胞减少症病毒(FPLV)的核苷酸序列同源性分别为99.32%、98.29%、98.52%,氨基酸序列同源性分别为98.87%、97.09%、97.77%.
