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猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析
对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析.采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序.经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷酸.与NCBI GenBank登录的国内外参考毒株进行同源性比较及系统进化分析结果表明,GXLC株与GXIO601、GXO602、BJC3、HB1等国内分离株以及CBNU、K3、K11、BEL2887A、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;基于全基因组、结构蛋白及非结构蛋白基因序列绘制的系统进化树拓扑结构图相近,所有EMCV分离株可分成两个群:Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV属于Ⅰa或Ⅰb亚群、鼠源EMCV属于Ⅰa亚群、野猪源EMCV属于Ⅱ群,GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群.
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地方土猪脑心肌炎病毒的分离、鉴定及全基因组序列分析
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种自然疫源性人兽共患病病原,但有关地方土猪EMCV的分离、鉴定及全基因组研究等尚未见报道.本研究应用“细胞接种与RT-PCR方法相结合”技术,成功分离到国内首株淮南猪源EMCV,命名为HNXX13株,并对其进行了系统鉴定和全基因组序列测定分析.结果显示,该病毒粒子大小约为24～30nm,呈圆形,不耐酸和热,对胰蛋白酶敏感,对氯仿不敏感,二价阳离子没有保护作用,所感染BHK-21细胞的细胞浆内可见到特异的绿色荧光;基因组全长为7 725bp(GenBank登录号:KF771002),与不同动物源参考毒株的核苷酸同源性为81.0％～99.9％,与国内猪源参考毒株同源性为99.5％以上;基于全基因组序列和ORF的系统发育进化树显示,EMCV可分为G1、G2和G3 3个群,HNXX13株与国内其他参考毒株同属于G1群.研究结果表明,地方土猪可感染EMCV并引起发病,丰富了我国EMCV分子流行病学资料,并提醒在进行地方品种养殖中要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学;EMCV存在较大的地域差异,其传播具有一定的区域限制性;EMCV在地方土猪和鼠之间可能存在着交叉感染与传播;EMCV在感染地方土猪时可能会发生个别氨基酸的突变,以适应不同的猪种.
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EMCV3C蛋白酶抑制真核细胞蛋白质合成的研究
目的 探讨脑心肌炎病毒(EMCV)的3C蛋白酶对真核细胞转录及翻译机制的影响.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1-3C,将表达载体分别与帽样依赖的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-N1和萤火虫荧光素酶(Fluc)载体pGL3载体共转染细胞后,检测GFP和Fluc的表达.Western Blot检测EMCV病毒和pcDNA3.1-3C对真核生物翻译起始因子4GI(eIF4GI)及多聚A尾结合蛋白(PABP)的影响.RT-PCR检测pcDNA3.1-3C对GFP mRNA转录水平的影响.结果 EMCV-3C可以抑制帽样依赖的GFP和Fluc的表达.EMCV 3C和EMCV病毒感染均导致细胞内PABP发生切割,而对eIF4GI均无明显作用.EMCV-3C也可导致GFP基因mRNA转录水平下降.结论 EMCV的蛋白酶3C通过mRNA转录水平的抑制和PABP的切割而抑制真核细胞帽样结构依赖途径的蛋白翻译,从而抑制蛋白质的合成.
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脑心肌炎病毒(EMCV)3C真核表达载体的构建及其功能鉴定
目的 EMCV的pEGFP-3C真核表达载体的构建及功能鉴定.方法 RT-PCR扩增EMCV功能蛋白3C基因并克隆至pEGFP-C3载体中,经双酶切和测序鉴定.将重组质粒分别转染到BHK-21细胞和293T细胞48 h后,Western-Blot检测3C蛋白酶的表达,以及对PABP1的切割,共聚焦显微镜观测3C荧光表达位置.结果 EMCV的pEGFP-3C重组质粒经双酶切及测序鉴定构建正确.表达的GFP融合蛋白相对分子质量约为49×103,可切割PABP1,并表达于细胞核内.结论 成功构建了EMCV的3C蛋白酶的真核表达载体pEGFP-3C,为进一步研究该蛋白酶的功能及作用奠定了基础.
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脑心肌炎病毒鉴定方法的初步研究
目的 摸索建立脑心肌炎病毒(EMCV)鉴定方法.方法 根据GenBank中EMCVVR-129B序列设计引物,提取病毒RNA,进行RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳检测片段大小.将DNA测序结果与GenBank中相同毒株EMCV序列进行比对.以RK细胞培养的全病毒作为免疫原制备抗血清,用于建立间接免疫荧光试验(IIFA)及中和试验方法,并验证方法精密性和特异性.制备抗GST-VP1和抗GST-VP2多克隆抗体,与EMCV浓缩液进行免疫印迹反应.结果 获得的DNA片段与GenBank中上传的相同毒株EMCV序列进行比对,相似性为98％～100％.采用20100901批抗血清160倍稀释作为一抗,建立IIFA方法,特异性好.检测20100901批抗血清中和效价1∶30 211,建立的固定病毒-稀释血清中和试验方法特异性、精密性好.抗GST-VP1和GST-VP2抗体与EMCV浓缩液于相对分子质量为33×103左右分别出现清晰单一条带,与理论值相符.结论 初步建立了用于EMCV毒株鉴定的RT-PCR、间接免疫荧光、中和试验及免疫印迹方法.
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脑心肌炎病毒 TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用
目的建立脑心肌炎病毒（ EMCV） TaqMan real-time PCR检测方法。方法根据GenBank中公布的EMCV 3D基因保守区段设计并合成1对引物和1条TaqMan 探针，建立EMCV TaqMan real-time PCR检测方法，且对体系进行优化；对该法进行灵敏性、特异性验证；采用建立的方法对98份猪血清样本进行检测，并与ELISA结果进行比较。结果建立的EMCV TaqMan real-time PCR检测方法线性关系较好，以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0．995；灵敏性比普通PCR高100倍，且仅能特异性检出 EMCV；对猪血清样本的检测与 ELISA 法检测结果符合率为98．0％。结论已建立了EMCV TaqMan real-time PCR检测方法，该法灵敏性高、特异性好，可用于EMCV的检测及定量分析。
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脑心肌炎病毒实验性疫苗免疫原性初步研究
目的：制备脑心肌炎病毒（ EMCV）实验性疫苗并对其免疫原性进行初步研究。方法采用Vero细胞培养EMCV病毒，微量细胞病变法检测病毒滴度；经过浓缩、过滤、超速离心等方法初步纯化EMCV；摸索病毒灭活方法；确定病毒半数致死量（ LD50）；通过肌肉注射途径免疫小鼠，微量中和试验测定血清中和抗体效价；免疫后小鼠分别以100LD50、50LD50和25LD50进行腹腔攻毒试验。结果以1∶4000β-丙内酯4℃放置12 h作为病毒灭活条件，病毒半数致死量17 CCID50/ml；免疫小鼠能检测到中和抗体并对病毒攻击具有抵抗力。结论 EMCV实验性疫苗能诱导小鼠产生保护性抗体。
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脑心肌炎病毒VP2基因真核表达质粒的构建
目的 构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)VP2基因真核表达质粒,并于CHO细胞中表达.方法 RT-PCR法扩增EMCV VP2目的基因,克隆至载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA3.1-VP2,脂质体法转染CHO细胞.转染48h后,RT-PCR法检测EMCV VP2基因mRNA的转录情况,免疫组化法及Western blot法检测EMCV VP2蛋白的表达情况.结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcDNA3.1-VP2构建正确.EMCV VP2基因mRNA及蛋白可在CHO细胞中正常转录及表达,且EMCV VP2蛋白可与兔抗EMCV阳性血清发生特异性结合,主要分布于CHO细胞膜上.结论 成功构建了重组质粒pcDNA3.1-VP2,并有效地在CHO细胞中进行了表达,为EMCV VP2基因体外表达及其功能的进一步研究奠定了基础.
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脑心肌炎病毒抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用
目的 建立脑心肌炎病毒( Encephalomyocarditis virus,EMCV)抗体双抗原夹心ELISA检测方法,用于EMCV血清学调查及临床检测.方法 采用EMCV基因重组蛋白VP1、VP2和2C作为包被抗原,HRP标记EMCV作为酶标抗原,建立EMCV抗体双抗原夹心ELISA检测方法；用内部参考血清对建立的方法进行评价,并与间接ELISA法进行比较；采用所建立的方法对1 475份人血清和l 309份猪血清进行检测.结果 建立的双抗原夹心ELISA法的佳抗原包被浓度为7.5μg/ml,封闭液为l0％马血清或2％鱼蛋白胨,酶标抗原稀释度为1:400.该方法的批内和批间变异系数均小于10％；热稳定性较好；与间接ELISA法检测结果的符合率为93.5％.应用建立的方法检测人血清和猪血清中的EMCV抗体阳性率分别为16.8％和63.4％.结论 已建立了EMCV抗体双抗原夹心ELISA检测方法,该方法可靠、稳定、特异、敏感、操作简便,为EMCV抗体的临床检测提供了有效的技术手段.
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脑心肌炎病毒蚀斑纯化及滴度测定方法的建立
目的 建立脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)蚀斑纯化及滴度测定方法.方法 将EMCV系列稀释后接种至单层Veto细胞,覆盖甲基纤维素,出斑后挑取蚀斑进行扩增,收获病毒液.选取5个EMCV原液样品感染Veto细胞进行蚀斑滴度测定,经结晶紫染色计数蚀斑,计算病毒滴度.重复测定5次,验证蚀斑法的精密性,并与微量细胞病变法进行比较.结果 EMCV感染Veto细胞后,约48 h出现边缘整齐直径为0.5～ 1.5mm的蚀斑,经结晶紫染色后,可见清晰透明空斑,边缘清晰.5个EMCV原液样品经蚀斑法测得的病毒滴度在3.16×106～1×107 PFU/ml之间,变异系数为0.88％～2.07％;经微量细胞病变法测得的病毒滴度均大于3.16×107 PFU／ml,变异系数为1.63％～2.90％,表明蚀斑法精密性更好;两种方法经直线回归分析,具有线性相关性(r=0.810,P=0.097).结论 建立了简便直观的EMCV蚀斑纯化方法及精密性良好的蚀斑滴度测定方法,为EMCV的生物学特性及疫苗研究奠定了基础.
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家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用
目的 以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体.方法 应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为包被抗原,建立间接ELISA标准化检测程序,并应用于临床检测.结果 经双酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒pET-28a-VP1构建成功,转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白,该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性;通过优化反应条件,确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为佳抗原包被浓度和待检血清佳稀释度,5％脱脂乳作为封闭液,待检血清的佳作用时间为37℃作用60 min,酶标抗体稀释度的佳工作浓度和佳作用时间分别为1∶8 000和37℃30 min,底物佳显色时间为20 min,特异性强,敏感性较高,重复性良好;应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清,发现阳性场检出率为65.87％,血清总阳性率为45.30％,不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场,EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14％.结论 应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平,临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白.
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河北省猪场脑心肌炎病毒感染的血清学调查
目的 了解河北省不同地区猪脑心肌炎病毒(EMCV)感染的流行情况.方法 于2006-2008年间从河北省10个地区的31个猪场共采集了1 306份血清,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中EMCV非结构蛋白2C特异性抗体,分析不同地区、不同生长阶段猪群的EMCV抗体阳性率.结果 1 306份血清中176份为EMCV 2C抗体阳性,总阳性率为13.48%;监测的10个地区中6个为抗体阳性,阳性率高为26%;种母猪的EMCV感染率明显高于其他生长阶段猪感染率.结论 河北省多个地区的猪场已经有EMCV感染存在,带毒母猪是猪群EMCV感染和流行的主要原因之一.
关键词： 猪 脑心肌炎病毒 抗体 间接酶联免疫吸附试验 血清学调查 -
家养野猪脑心肌炎病毒的分离、鉴定及全基因组序列分析
目的：分离家养野猪脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus ，EMCV），作全基因组序列测定及与相关物种同源性比较。方法用改进的“细胞接种与RT-PCR方法相结合”技术，成功分离到国内首株家养野猪EMCV JZ1202株，并对其全基因组序列进行测定和分子特征分析。结果分离毒的基因组全长为7735 bp ，与国内外不同动物源EMCV参考毒株的核苷酸同源性为81．2％～99．9％，与国内猪源EMCV分离毒的同源性高达99．4％以上。基于EMCV全基因组、ORF和VP1基因序列绘制的系统发育进化树显示，EMCV可分为 G1、G2和G33个群，JZ1202株与其他国内参考毒株同属于G1群。结论结果证实，家养野猪可感染EMCV并引起发病，提醒作野生动物养殖要考虑EMCV的传播；EMCV存在较大的地域差异，在家养野猪和鼠之间可能存在着交叉感染；EMCV在感染家养野猪时可能发生个别氨基酸突变，以适应不同的猪种。
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脑心肌炎病毒内部核蛋白体进入位点介导白介素-12基因在B16F1细胞中的表达
目的研究脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的鼠白介素12(mIL-12)的p40和p35双亚基基因在同一启动子的调控下能否得以有效地表达并形成异二聚体p70.方法采用脂质体法将表达经脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的p40和p35的质粒 mIL-12/AD1-1转染B16F1细胞,连续3d收集并换细胞培养液,并检测其中的mIL-12(p70)量.结果 ELISA结果显示,mIL12(p70)的表达量随着时间推移逐步下降,由第1天的15.5 ng/ml逐步下降到第3天的9.3ng/ml.表明mIL-12 p40和p35双亚基基因得到有效的表达并加工形成了异二聚体p70.结论脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的双基因p40和p35在同一启动子的调控下得以同时表达.但其上游和下游的基因蛋白质翻译机制是不同的.
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儿童急性呼吸道和消化道脑心肌炎病毒感染的检出和临床流行特征
目的 调查国内儿童急性呼吸道和消化道感染中是否存在脑心肌炎病毒(EMCV)感染.方法 对2013年1月至12月天津市儿童医院收集的577份急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物和384份消化道感染患儿粪便标本,以针对EMCV 5'-UTR基因序列设计的特异性引物进行荧光定量PCR扩增,随机挑选阳性扩增产物进行核苷酸序列测定,并将所测序列在GenBank中进行比对.同时对所有标本进行其他多种呼吸道、消化道相关病毒检测.采用直接免疫荧光测定法检测7种常见呼吸道病毒;金标法检测轮状病毒、腺病毒;酶标法检测星状病毒;PCR方法检测鼻病毒、多瘤病毒WU、多瘤病毒KI、人博卡病毒、诺如病毒、肠道病毒、Aichi病毒及双埃可病毒;实时荧光定量PCR法检测心病毒.结果 577份鼻咽抽吸物标本检测出7例EMCV阳性,阳性率为1.2％.患儿年龄均在6个月以内,检出季节为秋季和冬季;384份粪便标本检测出11例EMCV阳性,阳性率为2.9％.患儿集中在1岁以内及4～7岁,除春季外,其他3个季节均有检出.阳性患儿呼吸道及胃肠道症状以发热、腹泻为主,与其他呼吸道及肠道病毒感染类似.88.9％(16/18例)的患儿居住在郊县和农村.其中5例样本存在与合胞病毒、腺病毒、心病毒和诺如病毒的混合感染.混合感染患儿性别、年龄、住院时间、病情严重程度与单纯EMCV感染患儿相比,均无明显差异.结论 中国儿童存在EMCV感染,与呼吸道和消化道感染相关,需进一步检查其他感染是否与EMCV有关.
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人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用
目的：建立脑心肌炎病毒（EMCV）免疫球蛋白 M （IgM ）捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法，用于感染 EMCV 血清学早期诊断。方法用抗人 IgM （μ链）单抗进行包被，辣根过氧化物酶（HRP）标记的 EMCV为酶标抗原，初步建立 EMCV IgM 捕获 ELISA ；对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果建立的 EMCV IgM 捕获 ELISA 检测方法抗体包被浓度为1μg／mL ，EMCV‐HRP 工作浓度和反应时间分别为1∶400和45 min ，封闭液为10％马血清时该法检测效果可达佳，3批试剂批内及批间变异系数均小于5％，且特异性、精密性及稳定性较好。结论建立的 EMCV IgM 捕获 ELISA 法特异、精密且稳定，可用于人感染 EMCV的早期检查，为 EMCV 的诊断奠定基础。
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干热法对人血浆血管性假血友病因子冻干品中病毒灭活效果的观察
目的 探讨干热灭活法(dry heat treatment)对血管性假血友病因子(von willebrand factor,vWF)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的灭活效果.方法 以PPV或EMCV作为灭活指示病毒与vWF混合,并分别在(80±1)℃4、8、12、24、36、48、72 h,(90±1)℃4、12、24、36、48 h以及(99±1)℃5、15、30 min进行干热灭活处理.将在干热灭活前以及干热灭活后不同温度时间段的vWF样品接种ST细胞(swine testis)或Vero细胞培养,观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),用Reed-Muench法计算残余PPV和EMCV的病毒滴度.对无CPE的样品进行盲传3代培养,验证其灭活效果,并检测干热处理前后的vWF活性.结果 vWF中EMCV滴度在(80±1)℃、(90±1)℃以及(99±1)℃灭活条件下,均下降超过4.0 lg TCID50/0.1 mL,vWF中PPV的滴度下降也均超过4.0 lg TCID50/0.1mL.干热法灭活后vWF的活性下降<20％,质量稳定.结论 干热法可以灭活vWF中的PPV以及EMCV,且对样品的活性影响在允许范围之内.
