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鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析
将鸡贫血病毒(CAV)VP1蛋白449个氨基酸中的424个氨基酸(占95%)编码序列分二段,分别克隆入表达性载体pGEX-5X-3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAV的多克隆抗体.通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性.这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性.用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断.
关键词: 鸡贫血病毒 VP1 表达 多抗血清 间接免疫荧光试验(IFA) -
鸡贫血病毒衣壳蛋白基因克隆、测序和比较
在1979年日本首次报道鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)以后,相继在各养禽业发达的国家分离到了CAV[1].我国于1992年哈尔滨兽医研究所在哈尔滨市郊分离到CAV[2],并在其它多个省份用血清学方法检测到该病毒[3].
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凋亡素选择性抗肿瘤的分子机制
凋亡素(apoptin)是一种来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子量蛋白.CAV是一种无囊膜的DNA病毒,其基因组为2300 bp的单链环状DNA分子,含有3个完全或部分重叠的开放读码框,分别编码3个蛋白质:VP1、VP2和VP3[1].VP1为主要的衣壳蛋白,相对分子质量51 600.VP2为非结构蛋白,相对分子质量24 000,其具有双重性质的磷酸酶活性并且主要与VP1相互作用.VP1与VP2为CAV复制所必需[2].VP3亦称为凋亡素,相对分子质量13 600,能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡,如骨肉瘤、肝癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等,而不杀伤正常细胞[1,3-5].
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凋亡素在人体消化道肿瘤中的作用
细胞凋亡是细胞在其基因的调控下有序的死亡方式,是生物细胞的一种生理性死亡过程,对于维持整个机体的正常生理过程、保证个体正常发育起着重要作用.一旦细胞的增生和/或凋亡异常,均可导致细胞的恶性转化.凋亡素(VP3)来源于鸡贫血病毒,由366 bp组成,编码121个氨基酸序列的小分子物质,能够特异性诱导肿瘤细胞的凋亡,不依赖于p53,同时Bcl-2不仅不能抑制其活性,而且具有加速VP3诱导凋亡的作用,令人兴奋的是VP3对正常的人和鼠的二倍体细胞无任何毒副作用,其原因在于VP3特异性的核定位及其磷酸化所致.多种载体(细菌或质粒)具有独特的安全性能和/或免疫佐剂作用,经过分子生物学改造以后,能够表达外源基因并具有生物学活性,可以作为VP3释放系统,利用VP3在正常细胞和肿瘤细胞以及转化细胞中定位的不同以及VP3激酶在肿瘤细胞和正常细胞中表达的差异,对癌前病变或易于癌变的细胞进行检测,对预测肿瘤发生的倾向性和肿瘤的治疗具有重要的意义.因此VP3在抗肿瘤方面具有巨大的潜在优势和广阔的应用前景,对VP3进行深入细致的研究可能为恶性肿瘤的治疗开辟一条新的、有效的、安全的途径.
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凋亡素基因治疗系统对人肝癌细胞的影响
原发性肝癌的治疗是临床工作中的难题之一,近年来的研究表明,基因治疗可能是恶性肿瘤治疗的一条新途径.凋亡素基因是鸡贫血病毒基因组中一个编码基因序列[1],由其编码的蛋白为凋亡素(VP3)[2],通过合适的载体将凋亡素基因导入靶细胞,其编码的凋亡素能特异地诱导肿瘤细胞凋亡.本研究旨在构建凋亡素基因治疗系统,并观察其对人肝癌细胞HepG2的影响.
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改良型TAT-VP3基因表达对人膀胱癌细胞凋亡的诱导作用
VP3来源于鸡贫血病毒(CAV),又被称为凋亡素[1].TAT能够跨膜导入细胞内部.我们利用分子克隆方法构建了重组质粒PcDNA3-TAT-VP3,观察改良型TAT-VP3基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及诱导凋亡的效应.
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重组凋亡素基因特异性诱导卵巢癌细胞凋亡的体外研究
卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其死亡率位居妇科恶性肿瘤之首[1].随着分子生物学的发展,卵巢癌的治疗性研究已进入到基因水平.研究发现,利用合适的载体将鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)的凋亡素基因(即VP3基因)导入靶细胞,能特异性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无影响,提示凋亡素基因是用于恶性肿瘤基因治疗的一个理想的目的基因[2,3].迄今为止,国内外尚未有凋亡素基因对卵巢癌细胞影响的报道.
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Apoptin引起肿瘤细胞G2-M阻滞
目的:研究凋亡素(apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用,探讨其用于肿瘤治疗的可能性.方法:用PCR技术克隆了apoptin基因,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体,观察转染pcDNA3.1/FLAG/apoptin和/或Ad/apoptin重组腺病毒感染后apoptin在几种细胞中的表达及细胞形态的改变,用流式细胞术分析PI染色后Ad/apoptin感染细胞的DNA含量变化.结果:apoptin在Hela、Bcap37、A549、HepG2、SKOV3等肿瘤细胞核中表达,apoptin重组腺病毒感染后细胞核染色质呈颗粒状,后凝聚成不规则大块并出现核固缩.正向和反向插入apoptin的重组腺病毒均引起G2-M细胞增多,但前者引起G2-M阻滞更为显著,需要的感染复数(MOI)也较低.结论:apoptin可引起肿瘤细胞周期G2-M阻滞和染色质凝聚.
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鸡传染性贫血病
鸡贫血病毒是鸡传染性贫血病的病原.世界各国不同年龄的肉用型和蛋用型鸡均可发病,也可感染SPF鸡.鸡贫血病毒无囊膜、二十面体、单链环形DNA病毒,基因组长度为2.3kb.既可垂直传播,也可水平传播.引起鸡CAV综合症:表现为死亡率增加、造血器官骨髓萎缩、皮下和肌肉内出血、淋巴系统萎缩引起免疫抑制、皮肤损伤等.CAV只有一种血清型.临床发病及亚临床症状皆造成严重的经济损失.
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肿瘤特异性基因对黑色素瘤细胞凋亡诱导作用
近年来的研究发现,鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP3基因编码的一种蛋白质,可以通过独立于p53作用途径、不被Bcl-2抑制的方式,诱导人肿瘤细胞或转化细胞发生凋亡,而对人正常细胞没有毒性作用,故称之为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin).其独特的诱导凋亡作用,有望成为一种新的有效的抗肿瘤药物[1,2].我们在克隆和构建VP3基因真核表达载体的条件下,用该载体瞬间转染人黑色素瘤细胞A375,发现其对人黑色素瘤细胞A375具有明显的凋亡诱导作用.现将结果报告如下.
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凋亡素的抗肿瘤作用
细胞凋亡(Apoptosis)是机体的一种主动、程序化生理过程,受体内多种因素调节,凋亡过程的紊乱与肿瘤的发生发展密切相关.有研究者认为,病毒基因产物对凋亡有两方面的作用,一部分可抑制细胞凋亡,而另一些病毒基因产物则能诱导细胞凋亡[1-3].诱导细胞凋亡的病毒中,鸡贫血病毒(Chicken Anemia Virus, CAV)就是一种典型的具有特征性的代表,它的VP3基因被称为凋亡素基因(Apoptin),可独立诱导鸡成红细胞和成淋巴细胞发生凋亡,并具有诱导人肿瘤细胞或转化细胞等非正常细胞凋亡的作用[4].本文即对Apoptin的结构、功能及其抗肿瘤作用特点做一综述.
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鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达
目的:为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征.方法:采用PCR方法获得鸡贫血病毒的VP2基因,采用平端连接将其克隆到PUC119载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到PET载体上并进行原核表达.结果:发现CAV-SJ1株的VP2基因共有651个碱基,同国外TK5803、26P4、Cux-1、82-2毒株的VP2基因相比分别有6、7、8、7个碱基的差别,其中3个是SJ1株特有的碱基变化.由基因序列推导出的CAV-SJ1株VP2蛋白的氨基酸序列同这些毒株相比都有4个氨基酸的差别,同国外这些毒株共有7个氨基酸的差别.原核表达的融合蛋白分子量为34Kd,占菌体蛋白含量的10.5%.结论:CAV的分子生物学的特性较稳定,变化不大.
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鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗治疗荷SHG-44人脑胶质瘤大鼠的实验研究
目的 探索鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗(pVVP3)对SHG-44人脑胶质瘤生长的抑制作用.方法 构建荷SHG-44人脑胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分组给予不同的处理给药,观察治疗期间及治疗后的肿瘤生长情况,通过病理组织学、超微结构分析,检测pVVP3在Wistar大鼠体内的抗肿瘤作用.结果 pVVP3治疗组肿瘤生长速度明显受到抑制,其抑瘤率达90.58%.病理组织学及超微结构观察在pVVP3治疗组可见典型的凋亡特征.说明pVVP3对SHG-44人脑胶质瘤生长有抑制作用,可诱导肿瘤细胞凋亡.
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Apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用
目的:探索apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用.方法:构建荷C6胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分为荷瘤对照组、化疗对照组和pvVP3组,给予不同的药物,通过超微结构分析、TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率,观察apoptin诱导C6胶质瘤细胞的凋亡情况.结果:pvVP3组肿瘤细胞异染色质边集,细胞核固缩,凋亡小体形成,而荷瘤对照组则未见明显凋亡改变.TUNEL法检测肿瘤细胞pvVP3组凋亡率为51.11%,明显高于荷瘤对照组(28.96%)(P<0.01).结论:apoptin能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡.
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鸡贫血病毒VP3基因与人IL-18基因的共表达对人肝癌细胞BEL-7402的作用
目的利用凋亡素和IL-18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL-7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法.方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL-7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化.结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL-18所表达的目的蛋白对BEL-7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48 h,形态学观察表明BEL-7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化.结论联合应用凋亡素与hIL-18基因,在体外对人肝癌细胞BEL-7402具有明显的凋亡诱导作用.
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Apoptin-肿瘤基因治疗的新选择
人类肿瘤是在各种致瘤因子的作用下,局部组织的细胞在基因水平上对其生长失去正常调控,导致克隆性异常增生而来.其机制,一般认为是由于细胞原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活造成的.当上述基因非正常表达的时候,细胞的正常增殖、分化和凋亡等一系列生命过程出现异常,既表现为细胞的无限增殖、分化不良与凋亡减少.结果新生细胞不断产生、细胞的生存期延长.凋亡率下降使细胞数目不断增加导致局部生长优势,形成肿瘤.除了肿瘤细胞自身过度增殖以外,凋亡的异常在肿瘤发生、发展、结局等过程中起重要作用.因此,促进肿瘤的凋亡可能是肿瘤的一有效治疗途径.Apoptin由鸡贫血病毒(CAV)基因组中Vp3基因编码,可特异性的诱导转化细胞和肿瘤细胞凋亡且其凋亡作用不依赖于野生型p53也不受Bcl-2过渡表达的影响.Apoptin不杀伤人类正常二倍体细胞亦无毒副作用.此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景.
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鸡贫血病毒VP3基因抗喉癌的实验研究
目的评价鸡贫血病毒VP3基因在喉癌治疗中的效果,探讨其作用机理及安全性.方法建立人喉癌Hep-2株的裸鼠模型.制备鸡贫血病毒VP3基因真核重组表达质粒pcDNA3-(CAV)VP3,直接注入动物模型的肿瘤结节内.并绘制肿瘤的生长曲线,对残留肿瘤组织进行细胞组织病理学观察.结果全部裸鼠均成功荷瘤.给药3wk后,在实验组与对照组之间,鼠重、瘤重、瘤体积经t检验差异有显著性(P<0.01),证明pcDNA3-(CAV)VP3有抗肿瘤作用.结论 pcDNA3-(CAV)VP3治疗人喉癌裸鼠模型有效.
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凋亡素——候选抗肿瘤制剂
凋亡素是来自于鸡贫血病毒的一个小分子蛋白,能选择性地诱导肿瘤或转化细胞凋亡,对正常的人和鼠二倍体细胞无影响,而且它诱导的凋亡是不依赖肿瘤抑制基因p53,不受原癌基因bcl-2的抑制,相反过表达的bcl-2对其还有促进作用.对凋亡素及其选择性诱导细胞凋亡机制的深入研究,在肿瘤的预防和治疗中具有重要的理论和实践意义.凋亡素有望发展为一新的抗肿瘤制剂.
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鸡贫血病毒vp3基因的克隆和分子特征
目的 获得来源于浙江地区鸡组织中的鸡贫血病毒(CA)vp3基因并分析其变异情况.方法 根据GenBank登录的vp3序列设计特异引物,利用PCR方法从鸡组织中获得7个CAV的vp3基因克隆,将其克隆到载体进行测序.结果 40份鸡血清中共检出CAV阳性16份,阳性率40.0%.序列测定结果表明,vp3基因长366 bp,编码121个氨基酸,与GenBank登录的其他毒株vp3基因的核苷酸序列同源性为97.0% ~ 100.0%,氨基酸序列同源性为95.0% ~ 100.0%.结论 通过PCR方法扩增获得了CAV vp3基因,vp3基因及VP3蛋白总体上非常保守.
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凋亡素特异性诱导肿瘤细胞凋亡分子机制
来源于鸡贫血病毒(CAV)的凋亡素(apoptin)能选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞的凋亡,对正常人二倍体细胞无影响,而且它诱导的凋亡不依赖p53介导,不被bcl-2抑制,使其成为一种有前景的抗肿瘤制剂.该文就凋亡素诱导细胞凋亡的作用及其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制进行综述.